海藻提取物緩解高溫對櫻桃蘿卜脅迫效應的研究

王偉濤，賈春花，張林琳，王小華，孫玲麗，劉之廣，張 民，*

［1.土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東農業大學資源與環境學院，山東 泰安 271018；2.養分資源高效開發與綜合利用國家重點實驗室/金正大生態工程集團股份有限公司，山東 臨沭 276700；3.眾德肥料（平原）有限公司，山東 平原 253100］

高溫是制約蔬菜產量和品質提升的重要因素。高溫脅迫會引起葉綠體相關酶活性降低［1］、活性氧暴發、植物體代謝異常［2］、增強光抑制導致的光合效率下降等問題［3］；同時高溫誘導植物葉面積增大、蒸騰速率異常，使果實產量和品質大幅下降。大量試驗表明，高溫脅迫對以櫻桃蘿卜為代表的十字花科根莖類作物影響尤為顯著［4］。

海藻提取物是海藻類細胞破碎產物，其有效成分主要有褐藻膠、褐藻多酚、甘露醇、甜菜堿、不飽和脂肪酸等［5-6］，活性基團主要有半縮醛羥基、羧基和高密度的羥基等。半縮醛羥基的高度還原性能有效清除活性氧，酚羥基、醇羥基能提高基質保水能力并為植物提供有機碳源［7］，另外，羧基能提高離子緩沖性以及有效提高植物體內酶活性［8］、改善果實品質［9-10］。21世紀植物生物刺激素概念的提出規范并推動了海藻細胞破碎產物在農業領域的應用與發展［11］。目前主要研究了海藻提取物在緩解植物干旱脅迫、鹽脅迫、重金屬脅迫等方面的生物學效應。葉玉秀等［12］通過酶聯免疫法研究表明，海藻提取物能刺激植物細胞提高抗氧化酶活性，調節蒸騰速率緩解干旱脅迫對玉米幼苗的影響。李昉峻等［13］通過現代儀器分析手段研究表明，海藻提取物中的羥基基團與重金屬鎘發生絡合反應可以緩解鎘對水稻幼苗的脅迫效應。因此，海藻提取物在緩解高溫脅迫對以櫻桃蘿卜為代表的十字花科根莖類作物具有較好的應用前景，但是其生理機制尚不明確。

本試驗利用光照培養箱模擬高溫環境，施用不同濃度的海藻提取物對櫻桃蘿卜進行種植培養，通過測定果實鮮重和可溶性蛋白、葉片SPAD值和內源激素以及抗氧化酶系統相關指標，研究其緩解櫻桃蘿卜受高溫脅迫的機理機制，為指導海藻提取物在塊根蔬菜安全生產方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗在山東省泰安市山東農業大學土肥資源高效利用國家工程實驗室進行。供試櫻桃蘿卜種子來源于荷蘭BEJO公司，生育期45 d。供試海藻提取物是南非巨藻細胞壁破碎產物（有機質20 g·L-1，P2O5+K2O≥90 g·kg-1），來源于眾德集團（平原）有限公司。供試蕓苔素內酯為干物質量0.136%的粉劑，來源于上海拜諾國際生物科技進出口公司。

供試基質為蔬菜育苗基質，來源于丹麥品氏托普公司，理化性質為：有機質（434 g·kg-1）、NO3--N（296 mg·kg-1）、NH4+-N（84.1 mg·kg-1）、有效磷（P2O599.2 mg·kg-1）、速效鉀（K2O 1169 mg·kg-1）、pH 5.94（水基質比5∶1）、電導率2180 μS·cm-1（水基質比5∶1）。

供試育苗梯形方盒，上口邊長10 cm，高8 cm，底面邊長7 cm。自配營養液為利用N、P2O5、K2O比例為20∶10∶20的育苗專用肥料1000倍的水溶液［14］。

1.2 試驗設計

試驗共設置4個處理，每個處理3次重復。CK：無外源物質添加；BHG：施用濃度為66.7 mg·L-1的蕓苔素內酯；SWE-1，SWE-2：施用濃度分別為100.0、200.0 mg·L-1的海藻提取物。采用基質盆栽栽培的方式在智能光照培養箱中進行，相對濕度通過加濕器維持在50%～60%，光照強度約為15000 lx，晝夜溫度設置為30℃，每天設置光照16 h。

浸種時選取大小一致籽粒飽滿的種子分別置于不同濃度的海藻提取物中于25℃培養5 h。浸種結束后于30℃恒溫箱進行培養，分別將2粒種子播于基質層約0.3 cm深。播種后第5 d間苗至1株，第8和第16 d，均施用10 mL海藻提取物（蕓苔素內酯）兌40 mL營養液，即稀釋5倍后混勻灌根，培養24 d后測產。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 葉片酶活性及激素含量測定

生長素、脫落酸采用HPLC內源激素法測定，抗壞血酸過氧化物酶活性、谷胱甘肽還原酶活性采用酶聯免疫法測定，超氧化物歧化酶活性采用氮藍四唑光還原法測定，過氧化氫酶活性采用紫外吸收法測定，丙二醛含量采用硫代巴比妥法測定［15］。

1.3.2 櫻桃蘿卜果實品質分析

維生素C含量采用2，6-二氯靛酚滴定法測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定，可溶性還原糖含量采用3，5-二硝基水楊酸法測定［16］。

1.4 數據處理

ANOVA及Duncan差異顯著性檢驗采用SAS 8.2和Excel 2010完成，通過Excel 2010進行作圖。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫下海藻提取物對櫻桃蘿卜生物量及根冠比的影響

試驗結果（表1）顯示，SWE-1和SWE-2處理較CK處理果實鮮重分別顯著提高86.1%和180.0%，地上部鮮重分別顯著降低18.0%、16.8%，根冠比分別顯著上升125.0%和225.0%。與BHG處理相比，SWE-2處理果實鮮重顯著增加43.5%，根冠比顯著提高79.3%；而SWE-1處理果實鮮重差異不顯著。說明海藻提取物的施用能有效促進地下部果實膨大生長，更好地平衡地上部和地下部之間的關系，有效緩解高溫對櫻桃蘿卜的傷害。

表1 不同處理的櫻桃蘿卜的生物量和根冠比

2.2 高溫脅迫下海藻提取物對櫻桃蘿卜葉片SPAD值和硝酸還原酶活性的影響

葉綠素含量是評價植物光合能力的重要參數，硝酸還原酶是氮同化的關鍵酶。與CK處理相比，SWE-1、SWE-2的SPAD值顯著提高12.5%、16.8%（圖1）；硝酸還原酶活性顯著升高44.6%、57.7%（圖2）。與BHG處理相比，SWE-2處理硝酸還原酶活性顯著提高17.1%。SPAD值和硝酸還原酶活性的提高為海藻提取物處理櫻桃蘿卜獲得較高產量奠定了先行條件。

圖1 不同處理的櫻桃蘿卜葉片的SPAD值

圖2 不同處理的櫻桃蘿卜葉片的硝酸還原酶活性

2.3 高溫脅迫下海藻提取物對櫻桃蘿卜果實品質的影響

不同處理的櫻桃蘿卜果實品質指標見表2。與CK處理相比，SWE-1、SWE-2處理的維生素C含量分別顯著提升15.9%、49.1%，可溶性蛋白含量分別顯著提高26.4%、35.2%。與BHG處理相比，SWE-1、SWE-2處理維生素C含量分別顯著提升31.0%、68.4%，可溶性蛋白含量分別顯著提高39.9%、49.6%，還原糖含量分別顯著提高16.7%、16.7%。說明海藻提取物可提高果實中維生素C和可溶性蛋白含量。

表2 不同處理的櫻桃蘿卜果實的品質參數

2.4 高溫脅迫下海藻提取物對櫻桃蘿卜葉片中生長素、脫落酸含量的影響

SWE-1、SWE-2處理較CK處理葉片中生長素含量分別顯著升高44.5%和145.4%，脫落酸的含量分別顯著下降31.9%、42.0%；較BHG處理生長素含量顯著提升42.6%和142.2%，脫落酸含量顯著提高27.2%、49.4%（圖3）。植物在逆境條件下會調節脫落酸含量來調控葉片氣孔的開閉，高溫脅迫下海藻提取物對櫻桃蘿卜中脫落酸含量有顯著的影響。逆境條件下脫落酸含量的減少將有利于葉片氣孔的開放，使得蒸騰作用增強，減輕高溫對植物的熱害。

圖3 不同處理櫻桃蘿卜葉片中生長素和脫落酸含量

2.5 高溫脅迫下海藻提取物對櫻桃蘿卜葉片抗氧化酶系統的影響

較CK處 理，SWE-1和SWE-2處 理 葉 片 中的谷胱甘肽還原酶活性分別顯著提高11.7%和15.7%，抗壞血酸過氧化物酶活性分別顯著提高8.6%、9.4%，SWE-2處理過氧化氫酶活性顯著上升94.9%，SWE-1、SWE-2處理較CK處理的超氧化物歧化酶活性差異不顯著，但其丙二醛含量分別顯著下降50.0%、56.2%（表3）。較BHG處理，SWE-1和SWE-2處理的谷胱甘肽還原酶活性顯著提高19.4%、23.7%，抗壞血酸過氧化物酶活性分別顯著提高29.0%、29.9%，過氧化氫酶活性顯著提高178.1%、503.1%，丙二醛含量顯著下降33.3%、41.7%。試驗結果表明海藻提取物可以顯著降低葉片內丙二醛含量，提高作物的抗逆能力。

表3 不同處理櫻桃蘿卜葉片中抗氧化酶活性

3 討論

最新研究表明，高溫脅迫環境會引起植物細胞質外體環境的活性氧異常和細胞壁酸化［17］。這種質外體環境的化學變化能加速植物葉片細胞分裂和伸長，引起植物地上部葉片增大增厚從而抵御高溫環境的傷害［18-19］。雖然這種形態結構有利于抵御高溫熱害，但會造成櫻桃蘿卜歪倒、畸形，不利于農業生產。本試驗研究結果表明，海藻提取物能顯著提高高溫脅迫下的櫻桃蘿卜根冠比和果實產量。海藻提取物能有效制約因高溫脅迫引起的葉片形態異常的現象，這是一系列生理反應的綜合結果。

高溫脅迫條件下，植物為維持細胞正常生命活動，通過降低抗氧化酶活性并產生大量活性氧簇氧化細胞膜上的不飽和脂肪酸，來降低細胞膜的流動性，減少水分的擴散，增加比熱容，從而增強細胞的耐熱性［2］。海藻提取物的主要成分海藻酸、褐藻多酚、不飽和脂肪酸等均具有還原性，這些成分可能充當保護成分，保護植物細胞膜免受活性氧簇的傷害［5-6］。并且有研究表明，抗氧化酶活性與金屬離子有關（如過氧化氫酶等），海藻提取物能螯合金屬離子，降低金屬離子引起的副作用［20-21］。本研究表明海藻提取物能有效刺激植物，提高其抗氧化酶活性，減少活性氧，降低高溫脅迫對植物細胞膜的傷害。SWE-2處理較CK處理的谷胱甘肽還原酶、抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶活性分別顯著提高15.7%、9.4%、94.9%，而丙二醛含量顯著下降59.2%（表3），與Esserti等［22］研究結果一致，這說明海藻提取物對提高抗氧化酶系統活性具有重要作用。

前人研究表明，海藻提取物具有生物刺激素的功能，即海藻提取物具有持續提高植物生長素含量的效果。脫落酸主要在植物細胞處在不佳的狀態下合成，脫落酸在植物缺水生理反應（包括氣孔調節等）中的作用已得到充分證明［23］。而在水分充足的條件下，基礎水平的脫落酸有利于植物的生長和發育（包括適當調節氣孔孔徑、提高植物含水量等），并且在促進養分運輸和積累方面發揮積極作用［24］。本試驗研究表明，高溫下施用海藻提取物處理較清水處理生長素含量顯著提高145.4%，而脫落酸含量顯著下降42.0%（圖3），說明海藻提取物能有效提高櫻桃蘿卜在高溫脅迫下的生長能力，同時脫落酸含量的下降反映了植物水分生理狀態良好。但是引起這種激素含量變化的途徑有兩種解釋：一是海藻提取物本身含有的外源生長素，二是其他物質刺激植物所產生的內源生長素。哪種途徑才是引起這種激素含量變化的主要因素還有待研究，這也可能是造成海藻提取物效果不穩定的主要原因。

海藻提取物富含糖類物質，海藻多糖是一種天然高分子糖醛酸聚合物并且含有大量羧基，這種有機酸鹽具有一定的緩沖性，為植物提供穩定適宜的生長環境，其含大量羥基的結構決定了海藻多糖表面會形成一層致密的水膜從而具有緩釋效果，降解產生的糖會緩慢釋放被植物吸收［25-26］。高溫條件下，海藻提取物在改善櫻桃蘿卜果實品質上的表現也十分突出，SWE-2處理較CK處理櫻桃蘿卜的維生素C、可溶性蛋白含量分別顯著提高了49.1%、35.2%（表2），這可能與海藻提取物有效成分海藻多糖有關。

眾所周知，蕓苔素內酯是一種激素類物質，能直接刺激激素作用位點引起植物的響應；雖然在本試驗條件下，蕓苔素內酯處理櫻桃蘿卜超氧化物歧化酶活性和SPAD值均顯著提高，也起到一定程度上的抗氧化和提高光合能力的效果，但櫻桃蘿卜地上部鮮重占比較大，不利于農業生產，高溫脅迫引起的形態學效應依舊存在；而海藻提取物刺激植物提高了其谷胱甘肽還原酶、抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶活性，降低了丙二醛含量，SPAD值顯著提高，其中SWE-2處理較BHG處理果實鮮重顯著增加43.5%，根冠比顯著提高79.3%，海藻提取物在高溫脅迫下較BHG處理能更好地平衡地上部和地下部的分配關系，解決了高溫脅迫引起的形態學效應弊端，這可能是因為海藻提取物與激素類物質的信號傳遞途徑模式是不同的，其分子生物學機制還有待進一步研究。

本試驗條件下，海藻提取物提高了激素水平，增強了抗氧化系統相關酶活性，從而減輕高溫對植物的危害，為植物細胞創造了良好的生長環境，最終提高了果實產量、改善了果實品質。海藻提取物可與傳統肥料配合施用，提高作物的抗逆性，制備具有促生抗逆功能的增值肥料，市場潛力大。

4 結論

較清水處理，SWE-2處理條件果實產量顯著提高180.0%，根冠比顯著提高225.0%，可溶性蛋白含量顯著提高35.2%，葉片中生長素含量顯著提高145.4%，脫落酸含量顯著降低42.0%，谷胱甘肽還原酶活性顯著提高15.7%，丙二醛含量下降56.2%。因此，對高溫敏感的作物在受高溫脅迫時施用海藻提取物可以顯著改善葉片中相關酶的活性，從而增強抗逆能力，提高產量和品質。