不同濃度黃芩苷對高毒力肺炎克雷伯菌生長及生物被膜形成能力影響的初步探討

韓佳慧 劉唐娟 羅勁 黃海珠 陳一強

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)是臨床上重要的條件致病菌，主要分為經(jīng)典肺炎克雷伯菌(clinical Klebsiella pneumoniae , cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae , hvKp)，hvKp能夠在年輕的健康宿主中引起嚴重的、危及生命的社區(qū)獲得性感染，包括肝膿腫、肺炎、腦膜炎和眼內(nèi)炎等[1-2]。hvKp可在醫(yī)療植入物或組織表面形成生物被膜，從而增強對宿主防御因子和抗菌藥物的抵抗能力[2]。生物被膜的形成常導致慢性、難治性的感染，為臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)，使得尋找新型有效的抗菌藥物成為一個研究熱點。本研究擬探討黃芩苷對hvKp生長及生物被膜形成能力的干預作用，以期為開發(fā)新型抗菌藥物提供一定的理論依據(jù)。

資料與方法

一、試驗材料

1 菌株

收集2019年10月-2021年2月于我院臨床微生物檢驗鑒定中心鑒定的Kp。目前，關(guān)于hvKp的定義尚無統(tǒng)一標準，本研究根據(jù)拉絲試驗陽性結(jié)果伴有臨床侵襲性表現(xiàn)來定義hvKp，根據(jù)此方法從收集的臨床菌株中篩選出編號為hvKp3的實驗菌株，以Kp ATCC43816作為質(zhì)控菌株。(拉絲試驗[3]：用接種環(huán)輕觸瓊脂平板上的菌落，若有黏液絲且拉絲長度>5mm，即為拉絲試驗陽性。)

2 主要試劑

黃芩苷粉劑購自成都麥德生科技有限公司，MHA培養(yǎng)基、MHB培養(yǎng)基、二甲基亞砜、結(jié)晶紫均為北京索萊寶科技有限公司。

二、儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)，T6新世紀紫外分光光度計，THZ-82振蕩器(常州智博瑞儀器制造有限公司),VARIOSKAN LUX酶標儀(德國Thermo Fish有限公司)。

三、實驗方法

1 菌懸液制備

挑取hvKp3單個菌落接種到5 mLMHB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫水浴搖床中培養(yǎng)16～18h。用紫外分光光度計將過夜培養(yǎng)的菌液調(diào)至為OD600=0.1(約3×108cfu/mL)的菌懸液。

2 最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用肉湯微量稀釋法測定黃芩苷對hvKp3的MIC，ATCC 43816作為質(zhì)量控制。MIC定義為通過肉眼直接觀察，無細菌生長的最低藥物濃度。

3 細菌動態(tài)生長曲線的測定

取500μL上述菌懸液加入24孔板中，同時加入500μL黃芩苷藥液，使各組藥液終濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC,以不加黃芩苷的MHB培養(yǎng)基作為空白對照組，37℃、220 r/min恒溫水浴搖床中培養(yǎng)，每隔2h用酶標儀測定培養(yǎng)液600nm處吸光度(OD)值, 每組設(shè)置3個復孔，連續(xù)觀察24h，繪制細菌生長曲線。

4 抑菌率曲線的測定

取500μL上述菌懸液加入48孔板各孔中，然后再分別加入500μL黃芩苷藥液，使各組藥液終濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，同時以不添加黃芩苷的MHB培養(yǎng)基作為陽性對照，以不含菌液的MHB培養(yǎng)基作為陰性對照，每組作3個復孔。于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，用酶標儀檢測波長 600 nm下各孔內(nèi)液體的吸光度值(OD)，并計算各組的抑菌率。 抑菌率計算公式如下：抑菌率%=(ODr-OD/ODr-ODb)×100%。式中：ODr：陽性對照組的吸光值，ODb：陰性對照組的吸光值，OD：黃芩苷組的吸光值。分別統(tǒng)計黃芩苷的抑菌率，并繪制抑菌率曲線。

5 抑制生物被膜形成實驗

取500μL上述菌懸液加入48孔板中，并分別加入500 μL黃芩苷藥液，使各組藥液終濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，以不加黃芩苷的MHB培養(yǎng)基作為空白對照組，每組做3個復孔；37℃恒溫培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)24h后，行結(jié)晶紫半定量生物被膜形成及生物被膜內(nèi)活菌菌落計數(shù)。

以上試驗均獨立重復3次。

四、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、MIC的測定結(jié)果

黃芩苷對hvKp3、ATCC43816的MIC均為2048 μg/mL。

二、黃芩苷對hvKp3體外生長的影響

1 黃芩苷對hvKp3生長曲線的影響

采用24h細菌動態(tài)生長曲線法，研究1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四種不同質(zhì)量濃度的黃芩苷對hvKp3生長的影響，以MHB培養(yǎng)基作為空白對照，試驗結(jié)果(見圖1)。如圖所示，四種不同質(zhì)量濃度的黃芩苷均可減緩細菌的生長速度，具有明顯的抑菌作用。

圖1 黃芩苷對hvKp3生長的影響

2 黃芩苷對hvKp3的抑菌試驗

采用抑菌率曲線測定的方法，研究1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四種不同質(zhì)量濃度的黃芩苷對高毒力肺炎克雷菌體外生長的影響，試驗結(jié)果(見圖2)。黃芩苷對hvKp3的抑菌率隨其濃度增加而加大。

圖2 黃芩苷對hvKp3抑菌率的作用

三、黃芩苷對hvKp3生物被膜的抑制作用

1 結(jié)晶紫半定量生物被膜形成

采用結(jié)晶紫染色法研究了 1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四種不同質(zhì)量濃度的黃芩苷對hvKp3生物被膜形成的影響，以MHB培養(yǎng)基作為空白對照，試驗結(jié)果(見圖3、表1)。在終濃度為MIC、1/2MIC、1/4MIC的黃芩苷作用下，hvKp3形成生物被膜的能力得到明顯抑制，與空白對照組相比，差異具有顯著性(P<0.05), 而終濃度為1/8MIC的黃芩苷對hvKp3生物被膜的形成無明顯抑制作用(P>0.05)。

表1 結(jié)晶紫半定量吸光值

圖3 結(jié)晶紫半定量hvKp3生物被膜量

2 生物被膜內(nèi)活菌菌落計數(shù)

采用連續(xù)稀釋涂布平板法研究了 1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四種不同質(zhì)量濃度的黃芩苷對hvKp3生物被膜內(nèi)活菌計數(shù)的影響，以MHB培養(yǎng)基作為空白對照，試驗結(jié)果(見圖4、表2)。終濃度為MIC、1/2MIC、1/4MIC的黃芩苷可以有效抑制hvKp3生物被膜內(nèi)活菌的生長, 與空白對照組比較差異具有顯著性 (P<0.05) , 而終濃度為1/8MIC的黃芩苷組與空白對照組相比差異無顯著性 (P>0.05) 。

圖4 hvKp3生物被膜內(nèi)菌落計數(shù)

表2 生物被膜活菌計數(shù)(cfu/mL)

討 論

hvKp最早發(fā)現(xiàn)于1986年的一次臨床調(diào)查中，該調(diào)查報告了臺灣7例侵襲性肺炎克雷伯菌感染病例，患者主要表現(xiàn)為肝膿腫和感染性眼內(nèi)炎，一些患者還伴有其他感染綜合征，如肺栓塞、化膿性腦膜炎或前列腺膿腫[4]。1989年，其它國家也報告了類似的案例[5]。有研究表明hvKp可能取代cKp成為全球醫(yī)院和醫(yī)療保健相關(guān)的主要致病類型[3]。關(guān)于hvKp的定義尚無統(tǒng)一標準，目前無精確的方法來區(qū)分hvKp和cKp，多以高黏液表型作為高毒力的標志，故本研究根據(jù)拉絲試驗陽性結(jié)果伴臨床侵襲性表現(xiàn)從收集的Kp臨床菌株中篩選hvKp菌株。

生物被膜形成是hvKp重要的毒力因子，是hvKp產(chǎn)生多要耐藥的主要原因之一。細菌生物被膜的形成是一個復雜過程，主要分為初始粘附階段、早期生物被膜形成階段、生物被膜成熟階段、擴散與再定植階段，生物被膜的形成為細菌提供了有利于生存的惰性環(huán)境，賦予了細菌固有的抗生素抗性，為臨床上治療生物被膜相關(guān)感染帶來了巨大的困難[6]。越來越多的研究表明，中草藥在調(diào)節(jié)生物被膜形成方面具有抗菌和化學預防作用，可以為生物被膜相關(guān)感染的治療提供新的策略[7]。

黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為唇形科植物黃芩的干燥根，中醫(yī)臨床和中成藥中常用的中藥之一[8]。黃芩的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為黃芩苷，具有抗炎、抑菌、降壓、清熱解毒、利膽、利尿、抗變態(tài)、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、減輕組織的缺血再灌注損傷以及促進細胞凋亡等多方面的作用，尤以抑菌作用最為顯著[9]。眾多研究表明，黃芩苷可以調(diào)節(jié)細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)并抑制細菌生物被膜的形成[10-12]。本課題組前期研究已證明黃芩苷能抑制銅綠假單胞菌生物被膜及金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，并且可以增加抗生素對生物被膜的破壞和清除能力[13-15]。

在此基礎(chǔ)上，本研究主要探討黃芩苷對hvKp生長及生物被膜形成能力的作用。研究結(jié)果表明，在2048 μg/mL、1024 μg/mL、512 μg/mL的黃芩苷作用下，細菌生長速度明顯減慢，同時生物被膜量及生物被膜內(nèi)活菌計數(shù)均少于空白對照組；但是當黃芩苷終濃度為256 μg/mL時，雖然可減慢浮游菌生長，但不能抑制生物被膜的形成，256 μg/mL的黃芩苷作用下，hvKp生物被膜量及生物被膜內(nèi)活菌計數(shù)與空白對照組相比無明顯差異。我們推測當黃芩苷濃度≥512 μg/mL時，能夠滲入到細菌生物被膜深層結(jié)構(gòu)中，抑制生物被膜內(nèi)活菌的生長，降低hvKp的黏附作用，進而抑制了hvKp生物被膜的形成與成熟，而低于該濃度的黃芩苷，則不能抑制生物被膜的形成。