間充質干細胞治療新冠肺炎細胞因子風暴的臨床研究進展

陳娜 陳文燕 崔恩海

新冠病毒感染后，免疫系統被過度激活時會生成大量的炎癥因子，導致嚴重的細胞因子風暴。細胞因子風暴可導致肺及多器官損傷，繼而出現肺水腫、換氣功能障礙、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、急性心臟損傷和繼發感染，最終導致患者死亡。間充質干細胞(MSCs)是一類多潛能組織干細胞，在抗炎、再生、免疫調節等方面有著巨大潛力，能夠通過直接接觸或旁分泌多種細胞因子的方式調節免疫，適時抑制過激免疫反應，抑制細胞因子風暴，同時具有促進損傷組織恢復的能力。MSCs靜脈輸注在治療急性呼吸窘迫綜合征、急性肺損傷、重癥肺炎上已被證實具有良好的安全性和有效性，在治療新型冠狀肺炎的臨床試驗也已經廣泛開展。本文就MSCs用于控制新冠肺炎細胞因子風暴的情況作出綜述，提供進一步臨床研究參考信息。

對新冠肺炎的炎癥因子風暴與間充質干細胞治療可行性認識

自去年12月以來，新型冠狀病毒(COVID-19)在全球傳播迅速，造成了毀滅性的大流行，嚴重危害人們的健康。新型冠狀病毒肺炎，簡稱為“新冠肺炎”，輕者可表現為急性自限性癥狀，如發熱、乏力、干咳、流涕等，重者可出現急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)、膿毒癥休克、出凝血功能障礙以及多器官功能障礙綜合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)甚至死亡等[1]，目前尚無確切效果的可用于治療和控制COVID-19的預防性疫苗或有效抗病毒藥，主要采用對癥和支持療法。COVID-19具有獨特的免疫病理學[2]，重癥COVID-19患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞的數量常顯著減少，部分患者免疫系統因感染、藥物、自身免疫疾病等因素過度激活時，免疫細胞就會應激過度，產生過多的細胞因子會導致正反饋循環從而出現細胞因子風暴綜合征(Cytokine Storm Syndrome，CSS)，開始促炎性細胞因子(IFN-α，TNF-γ，IL-1β，IL-6，IL-12，IL-8，IL-33)和TGF-β的分泌增加，進而發展為急性呼吸窘迫綜合征，全身性炎癥反應綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome , SIRS)，多器官功能障礙綜合征，導致全身性衰弱性疾病患者的死亡率增加。HUANG等[3]在SARS-CoV-2感染病例首批臨床數據中的危重病人中可見細胞因子風暴的發生。細胞因子風暴是新冠肺炎患者輕癥向重癥和危重癥轉換的一個重要節點，有助于新冠肺炎的臨床分型以及預測發展的嚴重程度，并提供潛在的治療靶標[4]。細胞療法已經成為現代研究的重點領域。

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)又稱為多能間充質基質細胞，來源于胚胎發育早期的中胚層，MSCs可以進行體外擴增和自我更新，有損傷組織的趨化性及低免疫原性的特點，并且具有免疫調節功能，在臨床試驗中獲得廣泛關注。Meng[5]等主導的間充質干細胞治療新冠肺炎臨床試驗初步證明，臍帶血來源的MSCs(Umbilical Cord- Mesenchymal Stem Cells, UC-MSCs)用于治療新冠肺炎患者安全且耐受。多項臨床研究表明，通過間充質干細胞治療可改善新冠肺炎患者的呼吸功能和預后，為臨床治療提供了一個可行的方向[6]。基于目前研究狀況，現將進一步探討MSCs用于治療COVID-19的潛在作用機制以及評估其在臨床試驗中的可行性，以期提供MSCs潛在治療價值的參考信息。

間充質干細胞的免疫調節及抑制炎癥細胞因子風暴作用機制

MSCs在免疫調節和抗炎信號轉導方面的特性特別適合用于重癥COVID-19治療，主要是通過免疫細胞激活免疫應答，并參與非特異性免疫調節和特異性免疫調節。由于危重癥患者的免疫過度激活與免疫抑制轉化迅速，間充質干細胞能夠通過直接接觸或旁分泌多種細胞因子調節免疫細胞[7-8]，適時抑制過激免疫反應，保護肺泡功能，降低新冠肺炎患者肺臟和全身臟器損傷。

一、非特異性免疫應答和SARS-CoV-2感染

1 中性粒細胞與MSCs

COVID-19患者隨著病情進展白細胞計數、中性粒細胞百分比、絕對中性粒細胞計數、中性粒細胞與淋巴細胞比值(Neutrophil to Lymphocyte Ratio, NLR)逐漸增加[9]。在COVID-19患者肺部標本中發現肺毛細血管及肺泡腔中存在著中性粒細胞浸潤[10]。且患者支氣管肺泡灌洗液中，中性粒細胞計數被證實與COVID-19的嚴重程度和細胞因子風暴呈正相關。NLR升高與COVID-19患者的不良臨床特征和死亡相關，并被確定為重癥COVID-19患者感染的獨立危險因素[11]。MSCs可與中性粒細胞相互作用，通過IL-6介導抑制靜止期，中性粒細胞的凋亡，通過IL-8和巨噬細胞遷移抑制因子(Macrophage migration Inhibitory Factor, MIF)募集中性粒細胞[12]。骨髓間充質干細胞衍生的外泌體被證實可以顯著減少重癥COVID-19急性呼吸窘迫綜合征患者中性粒細胞的產生[13]，減少了免疫復合物介導的血管炎的血管破壞和出血。中性粒細胞可以在早期以趨化作用到達感染部位，通過活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的氧化爆發和吞噬作用殺死病原體。而MSCs能抑制氧化性爆炸誘導的中性粒細胞死亡和過氧化物酶/蛋白酶溢出，還可以減少中性粒細胞胞外殺菌網絡(Neutrophil Extracellular Traps , NETs)的形成[14]和吞噬中性粒細胞。NETs在COVID-19疾病的免疫病理學中，起著核心作用，針對NETs的治療可降低COVID-19的臨床嚴重性和死亡率[10]。MSCs在保留了中性粒細胞的基本功能的同時，防止氧化代謝的過度或不適當激活，從而在炎癥反應中發揮保護作用，中性粒細胞可能是重癥COVID-19患者免疫病理并發癥的靶標。

2 抗原呈遞細胞與MSCs

樹突狀細胞(Dendritic Cells, DC)是主要的抗原呈遞細胞，可橋接非特異性免疫應答和特異性免疫應答。Yang等[15]證實COVID-19患者肺部感染的DC可能是產生促炎細胞因子的來源，通過平衡Th1 / Th2反應和調節細胞因子的產生進而影響疾病進展。MSCs可以在PGE2的介導下抑制DC的早期成熟[16]。另外，MSCs可以通過jagged1/Notch途徑[17]，或肝細胞生長因子(HGF)/ Akt途徑[18]誘導成熟的DC(mDC)分化為低表達CD80和CD86的調節性DC(DCreg)，從而減輕肺部急性的病理損傷。巨噬細胞是抗原呈遞的重要組成部分，可分為M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞，前者可產生各種促炎因子來對抗與組織再生相關的病原體，后者可產生IL-10發揮免疫調節作用。在COVID-19早期到晚期病例中，SARS-CoV-2感染引起的局部炎癥的發生會激活該部位的巨噬細胞，迅速擴散到整個肺部。冠狀病毒S蛋白，通過在體外激活NF-κB途徑誘導人單核細胞/巨噬細胞的非特異性免疫應答[19]，巨噬細胞可通過炎癥因子影響單核細胞，中性粒白細胞和淋巴細胞等，成為細胞因子風暴的關鍵細胞[20]。而MSCs可以分泌TSG-6因子和IL-10來抑制NF-κB信號傳導通路和其他促炎途徑，還可以調節巨噬細胞極化，使M1型巨噬細胞分化為M2型巨噬細胞[21]，導致高水平的抗炎因子和低水平的促炎因子，通過增加IL-10以及減少TNF-α和IL-6的產生從而抑制炎癥進展并促進已受損組織的愈合。單核細胞在非特異性免疫應答中是重要效應器和調節劑，當肺損傷時，單核細胞在短時間內優先遷移至肺部炎癥部位，并促進中性粒細胞募集和放大肺損傷，最終分化為DC和巨噬細胞[22]。在重癥COVID-19患者中，單核細胞可能在細胞因子風暴病理過程中發揮著重要作用。MSCs被發現可以干擾單核細胞向DC和巨噬細胞的分化，進而在吞噬作用和抗原呈遞過程中起著抑制作用[23]。

3 自然殺傷細胞與MSCs

自然殺傷(Natural Killer, NK)細胞在非特異性免疫應答中發揮清除病毒和控制病毒感染的功能。COVID-19感染患者的支氣管肺泡灌洗液所含NK細胞的比例為中度感染明顯高于健康者，重度卻低于輕中度感染，康復期高于活動期，表明NK細胞的免疫狀態在一定程度上與COVID-19患者疾病的嚴重程度和預后相關[24]。體外高比例NK細胞與MSCs直接共培養時，MSCs不會影響NK細胞系的增殖，但會差異性調控NK細胞產生IFN-γ[25]。而NK細胞分泌IFN-γ可以激活MSCs從而發揮抗炎作用[26]。Ghanavatinejad等[27]證實月經血來源的MSCs可調節NK細胞的分化。MSCs與NK細胞相互作用復雜，主要包括三個機制：(1)細胞之間直接的細胞間接觸； (2)釋放外泌體，細胞因子(IFN-γ，TGF-β，IL-1等)和activin A等可溶性因子； (3)通過調節其他細胞(例如調節性T細胞)的間接作用。在將NK細胞作為治療靶點的相關疾病中，MSCs細胞具有作為治療工具的巨大潛力，可能會引發更具體、更理想的治療結果，在明確的條件下進行進一步的研究是非常必要的。

4 肥大細胞與MSCs

肥大細胞是非特異性免疫應答重要的前哨細胞，同時在促進血栓形成和其他并發癥方面發揮重要作用。此外，在COVID-19患者中發生的高炎癥性細胞因子風暴(Hyperinflammatory cytokine storms，HCS)可能源于SARS-CoV-2釋放組胺，增加IL-1水平，引起克隆性肥大細胞的功能失調引起的非典型反應[28]。Afrin等[29]初步發現COVID-19患者使用針對肥大細胞或其介體的藥物是有效的，MSCs對肥大細胞募集和脫粒不起作用[30]，但分泌出的轉化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β, TGF-β)可調節肥大細胞中的TNF-α，進而調節免疫[31]。

二、特異性免疫應答和SARS-CoV-2感染

1 T淋巴細胞與MSCs

CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞減少也是COVID-19患者的顯著特征，影響COVID-19的疾病嚴重程度和死亡率主要是CD8+T淋巴細胞，導致Th1/Th2不平衡[32]，而免疫系統因細胞因子風暴異常激活和失調進而出現嚴重的免疫失衡。MSCs可以通過TGF-β和肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)抑制G1期T細胞的增殖，也可以通過NKG2D途徑抑制異常激活的Th1細胞，恢復Th1 / Th2平衡。MSCs直接或間接抑制T細胞的活化，誘導IL-10的產生并抑制IFN-γ、TNF-α和IL-17的分泌，并上調IL-4的分泌，負反饋調節多種T細胞亞型的功能來改善特異性免疫狀態[33], 不同T細胞在未暴露的供體中靶向非結構性區域(ORF1的NSP-7和NSP13)以及核衣殼蛋白(NP)的多個區域，從而使體內環境從促炎狀態轉變為抗炎狀態。

2 B淋巴細胞與MSCs

B淋巴細胞在COVID-19感染期間患者體內抗體的產生和特異性免疫調節至關重要。COVID-19患者中性粒細胞計數增加，在炎癥環境下釋放可溶性BAFF，而BAFF水平與B淋巴細胞計數呈正相關[34]。B淋巴細胞被激活成漿細胞后分泌的抗體可以結合SARS-CoV-2結構蛋白S蛋白和N蛋白[35]，并以高免疫原性與S蛋白S1亞基結合潛在中和并阻止病毒與ACE2受體之間的相互作用[36]。MSCs可以抑制B淋巴細胞增殖，向漿細胞的分化以及分泌抗體，還可以誘導調節性B細胞，進而產生IL-10，從而發揮抗炎作用[37]。

MSCs治療COVID-19的可行性分析

目前有72項評估MSCs治療新型冠狀肺炎的安全性和有效性的臨床試驗在美國國立衛生研究院網登記注冊(https://clinicaltrials.gov)，并且其中30項已處于完成狀態。MSCs用于新冠肺炎患者治療的相關研究仍處于摸索階段，Hashemian等[38]的1期臨床試驗結果表明，多次、大劑量輸注同種異體產前來源(臍帶血與胎盤來源)的間充質干細胞是安全的，Meng等[5]的一項1期臨床試驗中未觀察到嚴重的人臍帶血來源的間充質干細胞UC-MSCs輸注相關不良事件，表明靜脈輸注UC-MSCs是安全的，中、重度新冠肺炎患者耐受性良好。最近，Shi等[39]在一項對100名重癥新冠肺炎患者的隨機、雙盲、對照的2期臨床試驗中發現，UC-MSCs治療新冠肺炎所致的肺損傷是一種安全且潛在有效的治療方法。

SARS-CoV-2通過表面的S蛋白與靶細胞的血管緊張素轉換酶2受體(ACE2)作用，從而感染細胞[40]。當患者的免疫系統為殺死病毒而被過度激活時，會生成大量的炎癥因子，導致嚴重的細胞因子風暴[3]，造成嚴重的器官損傷甚至死亡。避免細胞因子風暴可能是治療CoV-19感染患者的關鍵之一。

MSCs在抗炎、再生、免疫調節等方面有著巨大潛力，能通過直接接觸或旁分泌多種細胞因子調節免疫細胞[7]，包括中性粒細胞[12]、樹突狀細胞[15, 17]、巨噬細胞[21]、單核細胞[41]、自然殺傷細胞[25, 26]、肥大細胞[28, 31]等非特異性免疫應答途徑和T淋巴細胞[42]、B淋巴細胞等特異性免疫應答途徑。值得一提的是，Leng等[6]的研究發現，MSCs的ACE-2受體和TMPRSS2表達均為陰性，表明MSCs對SARS-CoV-2有著天然的免疫力，這一點提示MSCs治療新冠肺炎有著廣闊前景。

MSCs能夠通過直接接觸或旁分泌多種細胞因子調節免疫細胞，抑制細胞因子風暴，保護肺泡功能，降低新冠肺炎患者肺臟和全身臟器損傷，改善重癥新冠肺炎患者的身體情況[5, 38]。MSCs還可以通過旁分泌、細胞外囊泡的轉移或細胞與細胞的接觸，促進上皮和內皮細胞的恢復，促進微生物和肺泡液的清除[43]。

綜上所述，間充質干細胞的治療可以考慮作為控制新冠肺炎細胞因子風暴的策略之一。需要注意的是，這些臨床試驗存在一些局限性。首先，多數試驗樣本數量較小，可能存在誤差，結論可靠性存疑。其次，部分臨床試驗迫于情況緊急、捐獻來源減少等情況，起用冷凍庫存的間充質干細胞，其活力同新鮮來源的間充質干細胞可能存在差異。最后，還需要進行相關的3期試驗，以進一步評估MSCs用于預防新冠肺炎患者長期肺部殘疾、降低其死亡率的效果以及探究MSCs治療COVID-19疾病的潛在機制。