藍靛果單寧的提取及對酵母發酵能力的影響

韓春然，畢海鑫，王 鑫

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150028）

藍靛果（LoniceracaeruleaL），屬藍果忍冬的變種[1]。果實呈藍紫色橢圓狀，是一種含有多酚、花青素、黃酮、維生素等物質的天然野生漿果[2]，因具備抗突變、保護心臟等藥理特性，被稱為長壽水果[3-4]。藍靛果味道酸澀、不宜鮮食，多以果汁等飲品形式出現[5]。漿果果汁中，單寧釋放構成了果汁的口感骨架[6]，而果汁的澀感來源于單寧酸與人體口腔唾液蛋白結合引起的收斂感，對果汁特征的口感的形成是必要的[7]，但當單寧含量過多時，澀感物質或顆粒物進入口腔，在口腔軟組織內部形成表層，使唾液黏膜的潤滑作用降低，且摩擦作用增加[8-9]，人體感觸到的澀味加重。藍靛果加工成果汁后，酸澀感明顯且消費體驗較差，這是由于其單寧含量遠遠高于普通漿果，通常達到675～705 mg/L左右[10]。采用酵母菌發酵藍靛果果汁可以在一定程度上緩解其酸澀的問題，而單寧含量對果汁口感及酵母菌生長均有一定影響。因此，在保證果汁口感良好且不影響發酵效果的前提下，確定最適單寧含量，對于提高藍靛果果汁的感官品質至關重要。目前，關于漿果及果蔬中單寧的研究多集中于脫澀及提取等方面。如岳珍珍等[11]對刺梨果汁進行脫單寧處理，確定LX-60樹脂對單寧的脫除效果最好。張鑫[12]在黑果腺肋花楸汁的脫澀研究中發現，單寧酶及酵母脫澀后的果汁單寧含量最低，且營養成分仍保留。李曉靜等[13]確定了超聲波法提取香蕉皮單寧的最優條件。然而，藍靛果單寧提取及對酵母發酵能力影響，進而對發酵果汁品質的研究尚未見文獻報道。

基于此，本實驗通過超聲波輔助法探索藍靛果單寧的最優提取條件，對其純化后，將其添加到模擬藍靛果果汁中，考察藍靛果中所含的單寧對發酵藍靛果果汁中酵母菌發酵能力的影響，最后通過單寧酶對藍靛果果汁進行處理，在獲得最佳單寧含量的基礎上，進行果汁發酵，以驗證單寧對酵母菌生長及果汁品質的影響，從而確定藍靛果果汁中最適合發酵的單寧含量。為發酵藍靛果果汁的生產創造條件基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘蓓蕾’藍靛果 黑龍江省七臺河市，-4 ℃冷凍貯藏；LA-DE酵母菌 煙臺帝伯仕自釀機有限公司；單寧酸標準品 美國Sigma公司；D101大孔樹脂天津匯達化工有限公司；福林酚 上海藍季有限公司；無水乙醇 天津天力化學試劑有限公司；蛋白胨北京奧博星生物技術有限公司；單寧酶（食品級，酶活力100000U/g） 安徽中旭生物有限公司。

TD5A臺式高速離心機 湖南凱達儀器有限公司；UV-5200 紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；KQ-250DE超聲清洗器 昆山超聲儀器有限公司；折光儀 上海力辰有限公司；恒溫培養箱 上海智城儀器制造公司；DK-98-IIA恒溫水浴鍋 天津泰斯特有限公司；ZLG-10凍干機 寧肯夏亞康設備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單寧酸標準曲線及得率測定 采用福林-酚法測定[14]，量取單寧酸標準溶液（0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL）移入容量瓶中，加30 mL蒸餾水、2 mL福林酚試劑和10 mL飽和碳酸鈉，定容至50 mL，避光靜置顯色1 h，測量吸光度（765 nm）。得到標準方程為：y=0.0602x+0.0338，R2=0.9997。量取一定體積樣品提取液，同上述方法顯色后，根據線性方程及公式（1）計算樣品得率：

式中：C為樣品單寧酸濃度，mg/mL；V1為提取液總體積，mL；V2為提取液測定體積，mL；M為樣品質量，g。

1.2.2 超聲輔助法優化藍靛果單寧提取條件

1.2.2.1 單因素實驗設計 稱量5.00 g解凍打漿后的藍靛果于錐形瓶，與一定體積分數的乙醇溶液混勻，使藍靛果中單寧充分擴散至溶液中。經過超聲輔助提取、離心（5000 r/min、10 min）得上清液，即為藍靛果單寧粗提液。固定提取條件：料液比1:70，乙醇體積分數60%，超聲溫度50 ℃，超聲功率80 W，超聲時間40 min。分別考察料液比（1:50、1:60、1:70、1:80 g/mL）、乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%）、超聲時間（20、30、40、50 min）、超聲溫度（40、50、60、70 ℃）、超聲功率（0、20、40、60、80、100、120、140 W）對單寧得率的影響。

1.2.2.2 正交試驗設計 依據單因素實驗結果，選取乙醇體積分數、料液比、超聲溫度、超聲時間四個對單寧得率有顯著影響的因素，設計正交試驗對藍靛果單寧提取工藝參數進行優化，正交試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Orthogonal experimental factors and level

1.2.3 藍靛果單寧的純化及含量測定 參照尚俊等[15]方法，利用D101大孔樹脂吸附1.2.2最優條件下提取的單寧粗提液。將單寧粗提液與一定量已預處理過的樹脂混合，置于30 ℃、110 r/min的搖床中，振蕩24 h后過濾，以60%的乙醇溶液洗脫，再將提取液于45 ℃、0.065 MPa下旋轉蒸發濃縮后，冷凍干燥得藍靛果單寧酸樣品。單寧得率測定同1.2.1福林-酚法，按公式（2）計算：

式中：T為樣品單寧得率，mg/L；C為樣品單寧酸濃度，mg/mL；V1為樣品定容體積，mL；V2為樣品測定體積，L；n為稀釋倍數。

1.2.4 模擬藍靛果果汁及發酵液的制備 模擬藍靛果果汁：參照郭換麗等[16]的方法。準確稱取檸檬酸25 mmol/L，葡萄糖50 mmol/L，磷酸氫二銨25 mmol/L以蒸餾水溶解，調節pH為3.5。發酵藍靛果果汁的制備：在模擬藍靛果果汁中分別加入1.2.3得到的不同質量的單寧酸，得到不同單寧酸濃度（200、400、600、800、1000 mg/L）的待發酵的模擬藍靛果果汁于無菌操作下，接種2%活化好的酵母菌，于20 ℃進行恒溫培養。

1.2.5 酵母菌生長曲線測定 在無菌操作條件下，每隔4 h取發酵過程中不同濃度模擬果汁各5 mL，稀釋10倍，于560 nm下測定吸光度（OD值），以未接種的模擬果汁為對照，觀察不同濃度單寧酸模擬藍靛果果汁36 h內酵母菌的生長狀況，根據OD值繪制生長曲線[17]。

1.2.6 指標測定

1.2.6.1 理化指標 殘糖含量測定利用折光儀[18]；酒精度測定參照 GB/T 15038-2006《葡萄酒果酒通用分析方法》酒精計法[19]；總酸含量測定參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》酸堿滴定法[20]；總酯含量測定利用皂化法[21]。

1.2.6.2 澀度指標 模擬唾液的制備：準確稱取1.3 gKCl，0.1g NaCl，50 mg MgCl2，0.1 g CaCl2，25 μgNaF，27 mg KH2PO4和35 mg K2HPO4，溶解后，以蒸餾水定容至1 L，得電解質溶液；以該溶液為溶劑，溶解不同質量的蛋白胨，得模擬唾液蛋白溶液備用。

參照包賽依娜等[22]建立的澀感定量方法。將初始單寧酸含量不同的發酵模擬果汁與0～3 g/L不同梯度人體口腔模擬唾液蛋白溶液在37 ℃下作用2 h，10000 r/min離心5 min，測定上清液的吸光值（330 nm），以唾液蛋白濃度及吸光度作圖，發酵后模擬果汁澀度值由對數曲線斜率絕對值表示。

1.2.7 感官評價 評價小組由經過感官培訓的20人組成（男女各10人），分別以口感、香氣、狀態、色澤四項指標評定，具體評分標準見表2。

表2 藍靛果果汁的感官評價Table 2 Sensory evaluation standard for Lonicera edulis juice

1.2.8 驗證試驗 根據以上實驗確定藍靛果果汁的最適單寧酸濃度，采用單寧酶控制果汁單寧含量，并依據前期預實驗確定的單寧酶酶解最佳條件：水解時間60 min，水解溫度40 ℃，單寧酶添加量1.9 mg/ml，使其接近最適含量。將原果汁及單寧酶處理后得到的果汁分別接種2%的酵母菌，在20 ℃下發酵7 d，驗證最適單寧含量對藍靛果果汁品質的影響。

1.3 數據處理

所有試驗重復測定3次。通過SPSS 24.0進行實驗數據的顯著性差異分析（P＜0.05）。利用Excel 2016及Origin Pro 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 藍靛果單寧提取的單因素實驗結果

由圖1可知，單寧得率受料液比及溶劑濃度的影響顯著（P＜0.05），當料液比為1:70時，得率為最高值14.6%，當料液比增加至1:80時，得率呈下降趨勢，說明若繼續增加溶劑體積將不利于單寧的溶出，且可能導致資源浪費。而濃度為60%的乙醇溶劑極性更適宜單寧溶出，但濃度過高導致醇解反應[23]，單寧溶出速率遠低于其他雜質。綜合考慮，選取料液比為1:60～1:80、溶劑濃度為50%～70%進行后續研究。

圖1 料液比（a）及乙醇體積分數（b）對單寧得率的影響Fig.1 Effects of material-liquid ratio（a） and ethanol volume fraction（b） on yield of tannins

由圖2可知，在時間為40 min時，單寧得率最高（P＜0.05），此后時間延長，得率卻降低，由于單寧屬于多酚類物質，含有較多的酚羥基，其中鄰位酚羥基結構具有極強的還原性，導致單寧結構穩定性差，過長的超聲時間會使其結構氧化或分解。當超聲溫度為50 ℃時，單寧得率達到13.2%，說明此溫度能夠加快分子間的熱運動，從而加快單寧的擴散，使溶解速率提升。但當溫度持續升高，由于聚合單寧被液化而失去活性[24]，損失率增加，得率隨之下降。因此，確定溫度40～60 ℃，時間30～50 min的超聲條件進行后續研究。

圖2 超聲時間（a）及超聲溫度（b）對單寧得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time（a） and temperature（b）on yield of tannins

由圖3可知，功率為80 W時的得率最高，而當功率升高，得率卻呈下降趨勢，基于超聲波原理推測原因為：功率越大，超聲波加速作用越強，機械沖擊力推動了單寧粒子運動，加快其氧化分解，得率降低，且差異不顯著（P＞0.05）。因此，超聲功率確定為80 W。

圖3 超聲功率對單寧得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on yield of tannins

2.2 超聲輔助提取藍靛果單寧的正交試驗結果

根據表3的極差分析R值可知，影響藍靛果單寧得率的因素順序為D＞C＞B＞A，即乙醇體積分數＜料液比＜超聲溫度＜超聲時間。由表4可知，四個因素對單寧得率的影響均達到顯著水平（P＜0.05），該結果與極差分析結果一致。通過正交試驗分析得出，藍靛果單寧提取的最優條件為A1B1C2D3，即乙醇體積分數50%，料液比1:60 （g/mL），超聲溫度50 ℃，超聲時間40 min。此條件下重復3次試驗，藍靛果單寧平均得率為14.68%。

表3 正交試驗及結果Table 3 Orthogonal experiments and results

表4 正交試驗方差分析Table 4 Orthogonal experiments variance analysis

2.3 單寧對酵母菌發酵能力的影響

2.3.1 單寧酸對模擬藍靛果果汁中酵母菌生長曲線的影響 由圖4可知，酵母菌在不同濃度單寧酸模擬果汁中的生長規律具有典型性，生長趨勢大體一致，遲滯期均為0～4 h，在遲滯期內，400 mg/L單寧酸模擬果汁中酵母菌的活性較高，說明此濃度下酵母菌的起酵性能及對營養物質的吸收能力良好。在對數期內，濃度不同的模擬果汁中酵母菌的活性大小為400＞600＞200＞800＞1000 mg/L，且當濃度為200、600、800、1000 mg/L時，酵母菌生長穩定期均開始于20 h，此時對數期結束，直至32 h后酵母開始衰亡，生長趨勢下降。相比之下，400 mg/L單寧酸模擬果汁中酵母菌生長對數期為4～16 h，隨后進入穩定期，其穩定期持續時間最長、活性最高，說明此階段微生物積累代謝產物能力最強。因此，初步判斷400 mg/L單寧酸模擬果汁中酵母菌具有優良的發酵潛質。

圖4 不同濃度單寧酸模擬果汁酵母菌生長曲線Fig.4 Growth curve of simulated fruit juice yeast with different concentrations of tannin

2.3.2 單寧酸對模擬藍靛果果汁中殘糖量及酒精度的影響 酵母菌利用糖類物質進行糖酵解、丙酮酸脫羧、三羧酸循環等一系列生化反應，從而產生酒精[25]，酒精度的變化規律與殘糖量相符。由圖5可知，生長環境對酵母菌發酵能力變化影響顯著。低濃度（200 mg/L）單寧酸模擬果汁的殘糖量最高，為2.4%Brix，這是因為糖類物質作為發酵基質沒有被充分消耗，發酵效果不佳；而高濃度單寧酸（600、800、1000 mg/L）模擬果汁的殘糖量間無顯著差異（P＞0.05），且酒精度一致較低，可能是單寧酸濃度過高，由于發酵過程中酵母本身老化等原因，導致活性受到抑制，酵母菌對糖類物質消耗速率的影響較小。當單寧酸濃度為400 mg/L時，果汁的殘糖含量最少，酒精度最高，分別為1.8%Brix和1.2%vol，說明此環境下酵母菌耗糖速率最快，活力充足，酒精等代謝產物的積累相對較多。

圖5 不同濃度單寧酸對模擬果汁酒精度及殘糖量的影響Fig.5 Effects of different concentration tannic acid on simulated juice wine accuracy and sugar content

2.3.3 單寧酸對酵母菌產酸能力的影響 由圖6可知，不同濃度的單寧酸模擬果汁在產酸量與耗糖量方面的發酵特性相似，總酸含量變化各不相同。低濃度單寧酸（200 mg/L）模擬果汁的產酸能力最弱，說明此時酵母菌的分解代謝及啟酵速率遲緩；濃度為400和600 mg/L單寧酸模擬果汁的總酸含量相對較高，當單寧酸濃度繼續增大，產酸速率明顯下降且變化幅度較小，這表明當單寧酸濃度達到飽和時對酵母菌產酸速率基本無影響，即高濃度的單寧酸對酵母菌產酸速率基本無影響。

圖6 不同濃度單寧酸對模擬果汁總酸含量的影響Fig.6 Effects of different concentration tannic acid on total acid content of simulated juice

2.3.4 單寧酸對酵母菌產酯能力的影響 酯類作為藍靛果果汁香氣物質的主要載體[26]，發酵過程中成分變化復雜。由圖7可知，當模擬果汁中單寧酸的濃度增大，總酯含量呈開口向下的折線趨勢，即濃度為400 mg/L單寧酸模擬果汁的產酯能力顯著高于其它濃度模擬果汁（P＜0.05），其總酯含量達到2.87 g/L，說明在相同培養條件下，400 mg/L單寧酸模擬果汁中酵母菌自身代謝所需的營養物質（醇類、有機酸等）充足，利于酯類物質積累。

圖7 不同濃度單寧酸對模擬果汁總酯含量的影響Fig.7 Effects of different concentration tannic acid on total ester content of simulated juice

2.3.5 單寧酸對模擬藍靛果果汁澀度的影響 根據濃度不同的單寧酸模擬果汁與唾液蛋白溶液（0、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3 g/L）反應，建立吸光度與唾液蛋白質量濃度的對數曲線，如圖8所示。對數曲線方程及斜率絕對值見表5，以對數曲線斜率絕對值大小衡量果汁澀度的相對強弱。不同濃度單寧酸模擬藍靛果果汁澀度值結果見圖9。

圖9 不同濃度單寧酸對模擬果汁澀度的影響Fig.9 Effect of different concentrations of tannic acid on the astringency of simulated juice

表5 對數曲線方程及相關系數Table 5 Logarithmic curve equation and correlation coefficient

圖8 不同濃度單寧酸對模擬果汁與唾液蛋白反應曲線Fig.8 Reaction curve of different concentrations of tannic acid on simulation juice and salivary protein

由圖9可知，模擬果汁的初始單寧酸濃度對澀感強度有著直接影響，濃度為400 mg/L單寧酸模擬藍靛果果汁的澀度值最低（P＜0.05），而高于400 mg/L時，澀度加重。一方面，因為高濃度單寧酸產生的澀味與酸性模擬果汁中的澀味重疊，使澀感更強烈；另一方面，因為唾液蛋白的結構在酸性環境中不穩定，增大了其與單寧酸的結合幾率[27]，因此，對澀度的感知力增強。此外，有研究表明單寧的平均聚合度（Mean Degree of Polymerization，MDP）對澀感有一定影響[28]，當單寧MDP在酵母菌發酵過程中發生變化時，澀度值隨之改變。

2.4 單寧酸濃度對藍靛果果汁影響的驗證試驗

由上述分析初步確定藍靛果果汁中最適單寧酸含量為400 mg/L，而藍靛果果汁實際單寧含量為872 mg/L。在1.2.8中單寧酶酶解的最佳條件下，單寧含量可降低為401 mg/L，與最適含量接近。對原果汁及單寧酶處理得到的最適單寧含量的果汁進行酵母菌發酵，理化指標及感官評價結果見表6及圖10。

圖10 感官評價雷達圖Fig.10 Sensory evaluation radar diagram

由表6可知，與原發酵果汁相比，單寧酶處理過的藍靛果果汁經發酵后，糖類物質的消耗量明顯升高，酒精度、總酸含量分別提高84.21%和14.58%，總酯提高38.45%，澀度值降低86.32%。這表明，該最適單寧含量對發酵藍靛果果汁中酵母菌的發酵效果具有顯著促進作用，而且對果汁起到一定產酯增香作用，有效降低了果汁澀感。

表6 發酵藍靛果果汁理化指標Table 6 Physical and chemical indexes of fermented Lonicera edulis juice

由圖10可知，感官差異性主要表現為：原發酵果汁的酸澀感突出，殘存于喉嚨的后味時間較長，果香味淡薄，沉淀物肉眼可見，總體評分為66±1分。而最適單寧含量的發酵果汁口感飽滿，酸甜均衡且澀味適中，果香及發酵香醇厚，光澤度悅目，總體評分為（88±1）分。

3 結論

以單因素實驗為基礎，通過正交優化試驗確定超聲輔助法提取藍靛果單寧的條件為：乙醇體積分數50%，料液比1:60（g/mL），超聲溫度50 ℃，超聲時間40 min，此時藍靛果單寧得率為14.68%。

最優條件下提取的單寧粗提液經純化、濃縮，得單寧酸樣品。研究不同質量濃度單寧酸模擬果汁中酵母菌的發酵能力，并驗證最適單寧含量對發酵藍靛果果汁的影響。研究結果表明：濃度為400 mg/L單寧酸模擬果汁中酵母菌的生長規律具有典型性且趨勢良好，穩定期內活性最高。與原發酵果汁相比，采用單寧酶處理后，最適單寧含量對發酵藍靛果果汁中酵母菌的發酵效果具有顯著促進作用，果汁的澀感明顯降低且酸甜適中，果香及發酵香濃郁，酒精度為1.9%vol，總酸含量為14.88 g/L，分別提高84.21%和14.58%，殘糖含量降低57.91%。此外，總酯含量提高38.45%，澀度值降低86.32%，這是由于單寧酶的作用使果汁中部分縮合單寧被水解，同時較好地保存了發酵果汁所積累的香氣成分。

綜上所述，藍靛果果汁的最適單寧含量為400 mg/L，此時對酵母菌的發酵能力具有一定提升作用。研究結果可為后續深入探討藍靛果果汁的發酵技術及酚類物質濃度變化對果汁發酵品質的影響提供理論支持。