彩色馬鈴薯塊莖中花色苷分布差異及取樣方法探討

崔玲艷，楊 艷, ，王 瓊 ，徐笑宇，李凱峰，李茂興，白 磊，郭華春,

（1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南昆明 650201；2.云南農業大學機電工程學院，云南昆明 650201）

花色苷（anthocyanin）是植物中普遍存在的一種黃酮類次生代謝產物，可使植物器官呈現出紅色、紫色、藍色等顏色[1-2]。研究表明，花色苷在清除自由基、抗氧化[3-4]、抗炎[5]、調節血脂血糖[6]及抗癌抗腫瘤[7-9]等方面效果顯著。同時，從植物中提取獲得的花色苷亦可代替人工合成色素，能夠作為食品添加劑[10-11]。隨著對天然色素需求的不斷增多以及大健康產業的持續發展，富含花色苷的植物已成為天然色素生產的重要來源[12-13]。

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是全球第四大主糧作物，同時也是重要的工業原料[14]。彩色馬鈴薯因其所含花色苷穩定[15]、產量高、營養價值豐富、耐儲藏等特點，作為獲取天然花色苷的植物源材料之一[15]。近年來，我國的育種工作者加大了對彩色馬鈴薯的良種繁育，目前已培育出多個彩色馬鈴薯品種，例如“紫云1號”、“黑美人”、“黑金剛”等[16]。不同彩色馬鈴薯品種間花色苷含量差異較大[17]，是故對花色苷的精確定量成為彩色馬鈴薯種質資源評價的重要依據。張靜等[18]研究發現在整個馬鈴薯塊莖中，花色苷的含量高低分布依次為“皮”＞“環”＞“肉”，這一分布趨勢亦被報道于多數研究中[17-20]。Lewis等[21]研究發現馬鈴薯品種Desiree的花色苷首先在小塊莖的莖端（臍部）產生，之后才在芽端（頂部）合成，由此表明花色苷在馬鈴薯塊莖中的生物合成與積累存在分布性差異。

pH示差法與高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是科學研究和食品工業中常用的測定樣品內花色苷含量的方法[22]。Lee等[22]在2008年通過pH示差法和HPLC分析了7種含有不同花色苷的果汁，結果表明在測定樣品的花色苷總量時，pH示差法與HPLC法具有較高的相關性和一致度，pH示差法是一種簡單、經濟、快速并可靠的測定總花色苷的方法。樣品提取液的最大吸收波長跟樣品所含花色苷成份相關，成份相似則最大吸收波長相似[23]。

由于花色苷在塊莖中較為不均勻的分布，因此對塊莖的取樣方法在一定程度上影響了花色苷定量的準確性，探索如何通過有效取樣來實現對彩色馬鈴薯材料的鑒選與評價是研究花色苷在塊莖中分布積累機制的前提，同時也將有助于確認專門針對塊莖花色苷分析的科學取樣與定量分析手段?；诖?，本試驗以云南農業大學薯類作物研究所自主培育的彩色馬鈴薯品系21-1和云南地方品種劍川紅、主栽品種黑金剛為研究材料，通過采用不同的取樣方法，考察了花色苷在三份馬鈴薯材料的塊莖中的含量分布差異，探討可代表整個塊莖狀態的合理取樣方法，以期為富含花色苷的彩色馬鈴薯資源評價及后續深入探索其生物合成機制的研究提供相關參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

彩色馬鈴薯品系21-1（自育品系，來源于云南省地方品種劍川紅的自交種）、品種黑金剛、品種劍川紅 在云南農業大學校內試驗基地種植，三份馬鈴薯材料的表型特征如表1和圖1所示；無水乙醇 分析純，天津大茂化學試劑廠；氯化鉀 分析純，成都金山化學試劑有限公司；乙酸鈉 分析純，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑 均為國產分析純。

圖1 試驗馬鈴薯品種（系）Fig.1 Test potato varieties （lines） sampling diagram

表1 試驗材料Table 1 Test materials

紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；XZ-10 DTD超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Allegra 64R Centrifuge高速冷凍臺式離心機 貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；超純水器 北京歷元電子儀器有限公司；破壁料理機 沃佳健牌HH-1001。

1.2 實驗方法

1.2.1 花色苷提取 馬鈴薯花色苷提取方法，采用Fuleki等[24]的方法進行改進，稱取新鮮馬鈴薯樣品1 g，加入5 mL提取液（酸化乙醇，95%乙醇與1.5 mol/L鹽酸體積比85:15），磨碎，轉移到50 mL離心管中，用15 mL提取液沖洗研缽兩次，沖洗液轉移至50 mL離心管中，搖勻1 min后，放入溫度45 ℃，功率400 W超聲清洗鍋中，超聲提取30 min，在5000 r/min條件下，離心5 min，然后吸取上清液。將濾渣加10 mL提取液重提一次，將2次提取液合并，在5000 r/min條件下，離心5 min取上清液4 ℃避光保存。

1.2.1.1 樣品最大吸收波長比較 在pH示差法測定總花色苷含量時，為確定最大吸收波長，比較花色苷提取液與經pH1.0緩沖液（質量濃度為1.86 g/L的鹽酸-氯化鉀緩沖液，稱取1.86 g氯化鉀，加入蒸餾水至約980 mL，測其pH，用鹽酸調節至pH1.0，移入1 L容量瓶，用蒸餾水稀釋至容量瓶）稀釋的提取液，在可見光下測量最大吸收波長差異。

1.2.1.2 同株不同大小塊莖花色苷比較 將單株收獲的馬鈴薯，清洗晾干后，按大薯（≥100 g）、中薯（50～100 g）、小薯（≤50 g）分級，然后整薯切碎研磨（見圖2A），測定花色苷含量。

1.2.1.3 塊莖薯皮薯肉花色苷比較 用刮皮刀將薯皮與薯肉分離（見圖2B），分別測定薯皮與薯肉花色苷含量，比較花色苷含量差異。

1.2.1.4 塊莖橫切不同部位花色苷比較 沿著從頂部到臍部等距橫切馬鈴薯塊莖，將其分成頂部、中部、臍部三部分（見圖2C），分別測各部分花色苷含量。

1.2.1.5 塊莖縱切不同部位花色苷比較 將塊莖縱切成不同等份取對角或取其中一份（見圖2D）測其花色苷含量。

圖2 取樣示意Fig.2 Sampling diagram

1.2.1.6 不同樣品破碎方式對花色苷提取效果比較為找到更省力更簡單的方法，比較塊莖經刀片打漿機打漿與切碎研磨處理后花色苷提取差異。

1.2.2 最大吸收波長掃描 取花色苷提取液1 mL用pH1.0緩沖溶液（質量濃度為1.86 g/L的鹽酸-氯化鉀緩沖液）稀釋5倍，掃描400～650 nm之間的可見吸收光譜，以確定每個品種（系）在可見光區的最大吸收波長λmax。

1.2.3 總花色苷測定 采用pH示差法[23-25]測定塊莖中總花色苷含量。取花色苷提取液1 mL用pH1.0（稱取1.86 g氯化鉀，加入蒸餾水至約980 mL，測其pH，用鹽酸調節至pH1.0，移入1 L容量瓶，用蒸餾水稀釋至容量瓶）和pH4.5（稱取54.43 g乙酸鈉，加入蒸餾水約960 mL，測其pH，用鹽酸調節pH至4.5，移入1 L容量瓶，用蒸餾水稀釋至容量瓶）的緩沖溶液稀釋5倍，室溫下避光平衡60 min，以蒸餾水為空白，分別在最大吸收波長λvis-max和700 nm波長處測定吸光度Amax、A700。

總花色苷含量（total anthocyanins content, TAC）按矢車菊素-3-葡萄糖苷表示，公式如下：

式中：△A表示提取液在兩種pH下吸光度的差值；M表示花色苷分子量449.2 g/mol；DF表示稀釋倍數，本實驗中為5倍；V表示提取液體積（mL），本實驗中為30 mL；ε表示矢車菊素-3-葡萄糖苷消光系數26900 L/cm·mol；L表示比色皿寬度，本實驗中為1 cm；mf表示樣品質量，g。

1.3 數據處理

每個處理進行三次重復，采用SPSS Statistics 26進行數據處理與統計分析，通過Duncan法（P＜0.05）進行ANOVO分析，使用GraphPad Prism 8進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 不同品種（系）最大吸收波長比較

將三個馬鈴薯品種（系）的花色苷提取液分別經提取液和pH1.0緩沖液稀釋，直到最大吸收波長處的吸光度在分光光度計的線性范圍內，本研究中稀釋倍數為5倍。光譜掃描結果見表2，不同材料的薯皮和薯肉的花色苷提取液經提取液稀釋與經pH1.0緩沖液稀釋5倍后最大吸收波長差異顯著（P＜0.05），pH1.0緩沖液稀釋后最大吸收波長向前偏移。21-1與劍川紅最大吸收波長相近，表明二者的花色苷成份較為相似；黑金剛最大吸收波長與21-1，劍川紅最大吸收波長差異較大，一定程度上反映出黑金剛與其他兩個品種（系）的花色苷成分有所差異；同一品種的的薯皮和薯肉的最大吸收波長相近，表明其花色苷成份相似。通過該試驗確定黑金剛、21-1、劍川紅花色苷測定所使用的最大吸收波長分別為528、505、505 nm。

表2 花色苷提取液與緩沖稀釋液在可見光區的最大吸收波長比較Table 2 Comparison of the maximum absorption wavelengths of anthocyanins extract and buffer diluent in visible light region

2.2 同株不同大小塊莖的花色苷含量比較

不同品種（系）大、中、小薯的花色苷含量如圖3所示。黑金剛大、中、小薯花色苷含量存在顯著性差異（P＜0.05），其中，小薯的花色苷含量最高，大薯含量最低。品系21-1的三種類型薯塊的花色苷含量在大薯和中薯間差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于小薯（P＜0.05）。相比之下，劍川紅大、中、小薯的花色苷含量均存在顯著差異，表現為大薯＞中薯＞小薯（P＜0.05）?？傮w上，三個品種（系）花色苷含量不同，而且大、中、小薯間差異明顯。

圖3 同株不同大小塊莖花色苷分布差異比較Fig.3 Comparison of anthocyanins distribution in tubers of different sizes in the same plant

2.3 彩色馬鈴薯薯皮與薯肉間花色苷含量的差異比較

三個品種（系）橫向不同部位花色苷含量如圖4所示。黑金剛薯皮中花色苷的含量為105.7 mg/100 g FW，薯肉中花色苷含量為42.9 mg/100 g FW，薯皮中花色苷含量是薯肉中花色苷含量的2.5倍，黑金剛薯皮與薯肉花色苷含量達到顯著性差異（P＜0.05）；21-1薯皮中花色苷含量為34.5 mg/100 g FW，薯肉中花色苷含量為22.5 mg/100 g FW，薯皮與薯肉中花色苷含量差異顯著（P＜0.05）。劍川紅薯皮中花色苷含量為19.5 mg/100 g FW，薯肉中花色苷含量為2.7 mg/100 g FW，薯皮中花色苷是薯肉花色苷含量的7.2倍，兩者差異達顯著水平（P＜0.05）。

圖4 彩色馬鈴薯塊莖花色苷橫向分布差異比較Fig.4 Comparison of lateral distribution of anthocyanins in colored potato tubers

2.4 彩色馬鈴薯塊莖花色苷縱向分布差異比較

不同品種縱向不同部位花色苷含量如圖5所示。對黑金剛品種在形態學上的塊莖頂部、中部、臍部花色苷含量進行方差分析，結果顯示其頂部、中部、臍部花色苷存在顯著性差異（P＜0.05），中部花色苷低于頂部和臍部，頂部和臍部花色苷含量差異不顯著（P＞0.05）。品系21-1塊莖中3個部位花色苷含量差異顯著（P＜0.05），中部含量低于頂部和臍部，頂部與臍部的花色苷含量差異不顯著（P＞0.05）。劍川紅頂部花色苷含量從頂部到臍部花色苷逐漸降低，縱向分布上差異顯著（P＜0.05），頂部花色苷含量顯著高于中部和臍部（P＜0.05），中部和臍部差異不顯著（P＞0.05）。

圖5 彩色馬鈴薯塊莖花色苷縱向分布差異比較Fig.5 Comparison of longitudinal distribution of anthocyanins in colored potato tubers

2.5 彩色馬鈴薯塊莖縱切不同等份取樣方式差異比較

黑金剛、21-1、劍川紅縱切不同等份取對角花色苷含量測定結果如圖6A所示。黑金剛、21-1、劍川紅縱切不同等份取對角花色苷含量方差分析結果顯示，整薯、縱切四等份取對角、縱切八等份取對角所測花色苷含量無顯著性差異（P＞0.05）。

圖6 黑金剛、21-1、劍川紅縱切后取對角或取一部分所測花色苷含量的變化Fig.6 Changes of anthocyanin content in Heijinggang, 21-1 and Jianchuanhong measured by taking a diagonal angle or part of it after longitudinal cutting

通過對三個品種（系）馬鈴薯塊莖縱切兩等份、四等份、八等份，各取其一份與整薯花色苷含量測定結果相比如圖6B所示。黑金剛、21-1、劍川紅4種取樣方法花色苷含量方差分析顯示，4種取樣方法花色苷測定結果無顯著性差異（P＞0.05）。

2.6 不同粉碎方式對花色苷含量測定結果比較

三個品種（系）馬鈴薯塊莖采用打漿與研磨兩種粉碎方式進行花色苷含量測定結果比較見圖7，結果顯示，三個品種（系）打漿處理的花色苷含量測定結果顯著（P＜0.05）低于研磨處理花色苷含量測定結果。黑金剛研磨測定的花色苷含量為47.91 mg/100 g FW，打漿機打漿測定的花色苷含量為18.01 mg/100 g FW，打漿比研磨使花色苷含量測定降低了60.0%；21-1研磨測定的花色苷含量為35.19 mg/100 g FW，打漿機打漿測定的花色苷含量為22.49 mg/100 g FW，花色苷含量測定結果降低了30%；劍川紅研磨測定的花色苷含量為4.47 mg/100 g FW，打漿機打漿測定的花色苷含量為0.55 mg/100 g FW，花色苷含量測定結果降低80%。三個品種（系）的方差分析結果都表明打漿后使花色苷含量測定結果急劇下降。

圖7 不同粉碎方式對花色苷含量影響比較Fig.7 Comparison of effects of different grinding methods on anthocyanin content

3 討論與結論

本研究通過比較同種馬鈴薯薯皮和薯肉及不同品種花色苷的最大吸收波長，結果表明，同種馬鈴薯薯皮、薯肉顏色相近，花色苷最大吸收波長相近，表明所含的花色苷種類相似。不同品種（系）間花色苷最大吸收波長不同，表明不同品種（系）間花色苷種類不同，這與殷麗琴等[23]研究結果一致。品系21-1是由劍川紅實生種培育而來，因此與劍川紅顏色相近，最大吸收波長亦相近，表明二者之間的花色苷種類相似（見表2）。本研究發現花色苷提取液最大吸收波長與經pH1.0緩沖液稀釋后的最大吸收波長不同，查閱相關文獻可知[26]，采用經pH1.0緩沖液稀釋后掃描得到的最大吸收波長進行相應的定量結果最為可靠。為了數據可比性兼統一標準，美國分析化學家協會AOAC（Association of Official Analytical Chemists）頒布了《果汁、飲料、天然著色劑和葡萄酒中總單體花色苷的含量 pH示差法》的標準規定，最大吸收波長一般采用520 nm[27]。

本研究還發現同一植株中大、中、小薯花色苷含量存在顯著性差異（P＜0.05）（見圖3），且差異趨勢因品種（系）而異，可能原因是同一植株中大、中、小薯處于不同發育階段導致。李倩等[28]研究發現不同馬鈴薯品種的花色苷含量隨塊莖發育階段呈不同變化，顏色較深的品種Adirondack在塊莖膨大初期即升到較高水平，在發育后期略微下降；而顏色較淺的品種All Red花色苷含量在薯塊剛開始膨大時較少，隨后逐漸累積，在薯塊最大時花色苷含量達到峰值。是故在研究彩色馬鈴薯花色苷合成及含量相關研究時，必須選擇大小一致的塊莖進行研究。

前人研究已證實，花色苷合成具有組織特異性[29-30]，跟顏色呈正相關[2]。一般顏色較深的部位花色苷含量較高，顏色較淺則較低?；ㄉ赵隈R鈴薯全身都存在，花、葉、莖、塊莖內都含有，而且積累存在差異。本研究通過對三個品種（系）的薯皮和薯肉花色苷測定結果發現（見圖4），薯皮中花色苷含量顯著高于薯肉，而且差異倍數與品種本身有關，這與前人[18-20]的研究結果一致。此外，次生代謝產物在馬鈴薯塊莖上即存在徑向和縱向上的分布差異[31]。通過試驗分析，彩色馬鈴薯花色苷含量在塊莖中縱向分布含量差異顯著（見圖5），而且隨品種而變化，有些品種的頂部和臍部花色苷含量高，如黑金剛、品系21-1，而有些品種的頂部花色苷含量高，臍部含量低，如劍川紅。Lewis等[21]研究發現馬鈴薯品種Desiree的花色苷首先在塊莖的莖端（臍部）產生，之后才在芽端（頂端）產生，表明花色苷的生物合成與積累在塊莖的縱向上分布不均勻。彩色馬鈴薯內花色苷在橫向和縱向上的分布差異，直接影響著塊莖取樣方式的選擇。考慮到塊莖內存在花色苷橫向和縱向上的分布差異，因此如果為了獲得整個馬鈴薯塊莖的花色苷含量，取一個同時包含橫向和縱向各部位的樣本才具有代表性。根據本研究的結果，塊莖縱切后隨機取1份、取對角2份與取整個塊莖三種取樣方式對花色苷含量的分析結果無明顯變化（圖6），反映出通過縱切取少部分的薯塊樣本即可代表整體馬鈴薯塊莖的花色苷含量水平。因此該取樣方法能夠有效適用于珍貴的種質資源取樣，以及轉基因株系等材料在有限條件下的快速花色苷定量分析。Griffiths等[32]在研究中測定馬鈴薯糖苷生物堿時也是采用的縱切取對角的方法，由此表明這一取樣方式亦能夠較好地應用于馬鈴薯塊莖中次生代謝成分的快速檢測。

在樣本量充足的情況下，本研究設想通過使用更為省力快捷的打漿機來代替研磨，以達到省力及樣本量大目的，試驗結果表明，打漿機處理樣品后花色苷含量的測定結果明顯降低，這與一些報道結果相似[33]，很可能是打漿后的樣品花色苷遭到破壞或部分氧化，所以無法準確用于定量花色苷。因此，利用打漿的方式來代替研磨在植物鮮樣的花色苷定量分析研究中可行性較低，不建議采用。

本文研究的意義在于，明確了彩色馬鈴薯花色苷在塊莖中分布存在差異性會導致取樣方式不同對檢測結果產生影響，得出了反映整體樣本真實狀態的取樣方式。

彩色馬鈴薯花色苷合成是一個復雜的催化過程，受調節基因合成的轉錄因子和結構基因編碼的酶共同影響[34]。通常，MYB、bHLH和WD40是調控植物中花色苷生物合成的主要轉錄因子，由結構基因編碼的PAL（苯丙氨酸解氨酶）、CHS（查爾酮合酶）、F3H（黃烷酮-3-羥化酶）、ANS（花青素合成酶）等是關鍵的限速酶[35]?；ㄉ盏拇x機制與其他碳同化產物高度偶聯[36]，因此在一定程度上，彩色馬鈴薯塊莖中差異分布與積累的花色苷或許也影響了其他初生/次生代謝產物的合成。本研究主要關注于馬鈴薯花色苷，并未對如淀粉、蛋白質、還原糖、糖苷生物堿等塊莖特異成分開展具體分析，是故后續的研究將關注于花色苷合成與其他重要碳代謝通路之間的互作及在塊莖不同部位的積累差異。