蝦青素調控ROS介導的自噬延長秀麗隱桿線蟲壽命作用

付 敏，張旭光，楊 柳，張緒梅，劉 歡,

（1.天津醫科大學公共衛生學院，天津 300070；2.湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州 510663）

衰老是一種自然的、不可避免的生命過程，以細胞衰老為基礎，機體各組織器官、生理功能隨年齡增長發生不可逆的退行性改變[1]。伴隨衰老進程，自由基不斷積累對細胞和組織造成氧化損傷[2]，這也被許多研究證明是衰老的主要因素之一[3]?；钚匝酰≧OS）屬于自由基的一種，有研究發現ROS在信號轉導，基因調節和氧化還原調節等生理方面至關重要，完全將其清除是有害的，保持一種適度的低劑量水平可促進自噬的形成[4]。自噬是一種分解代謝過程，通過吞噬細胞內受損的細胞器，改善細胞微循環，從而發揮其抗衰老作用[5]。自噬活性會隨著年齡的增長而逐漸減弱[6]，自噬缺乏會導致細胞中突變蛋白和錯誤折疊蛋白的積累，這是神經退行性疾病和其他衰老相關疾病出現和發展的基礎[5]。

蝦青素（astaxanthin，AST）屬于類胡蘿卜素，是一種超級抗氧化劑和自由基清除劑，AST具有共扼雙鍵和α-羥基酮，使其容易捕獲并中和自由基，淬滅單線態氧，清除自由基，在許多生物體中扮演強抗氧化劑的角色[7-8]。目前，有關AST延緩衰老的研究備受關注，Yazaki等[9]和Liu等[10]發現，AST可通過調節線蟲IIS信號通路相關基因和氧化還原酶系統，維持細胞內ROS的最佳平衡，從而達到延緩衰老的作用。AST在心臟、腎臟、肝臟和肺中均能調控自噬從而調控細胞損傷[11]。本團隊前期的研究也發現AST通過上調IIS通路的daf-16和TOR通路的hlh-30激活自噬從而延長線蟲壽命[12]。而適宜水平的ROS能夠調控自噬[13]，但在AST延長壽命的效應中ROS和自噬是否存在相互作用還需進一步的研究。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）簡稱線蟲，是一種多細胞真核生物，個體結構簡單、壽命較短、遺傳背景清楚、繁殖速度快且易培養，在基因及信號通路上和人類比較保守，與人類有60%～80%的基因相似，是研究衰老的經典模型生物[14]。因此，本研究選取了線蟲作為研究對象探討AST延緩衰老的作用及其分子機制，以期為AST作為抗衰老藥物或保健品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型線蟲Bristol N2（wild type，WT）、線蟲DA2123、GFP::LGG-1（adIs2122）、大腸桿菌Escherichia coliOP50（E.coliOP50） 美國明尼蘇達大學的線蟲中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）；谷草轉苷酶（AST） 北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、胡桃醌 美國Sigma公司；五氟尿嘧啶（FUDR） 天津市風船化學試劑科技有限公司；兔抗GFP多克隆抗體 美國Abcam；山羊抗鼠二抗中國博奧森生物技術有限公司。

生物培養箱 美國THERMO FISHER公司；SZX16體式顯微鏡 日本OLYMPUS公司；超凈工作臺（Esco Airstream） 新加坡ESCO公司；倒置熒光顯微鏡（IX81） 日本OLYMPUS公司；震蕩培養箱 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲同期化 使用M9緩沖液將體內含有大量卵的成蟲從NGM培養基上沖洗至離心管中。加入1 mL的M9緩沖液和1 mL的線蟲裂解液（1 g NaOH，加入5 mL的NaClO2，95 mL超純水），劇烈搖晃的同時在顯微鏡下實時觀察，當看到蟲體裂解而蟲卵保存完好時停止振蕩，1000 r/min離心2 min，除去上清，重復兩次，即可得到蟲卵。然后用M9緩沖液沖洗三次去除裂解液。蟲卵在M9緩沖液中20 ℃恒溫培養12 h。蟲卵孵化以后，由于沒有食物，幼蟲發育將停滯在L1期。然后將幼蟲加入NGM培養基中繼續培養，待其長至L4期方可用于后續實驗。

1.2.2 實驗分組及干預方法 根據AST的濃度分為對照組（0 μmol/L）和AST干預組（120 μmol/L）。AST用DMSO溶液溶解配制成120 mmol/L的貯存液，細菌過濾器過濾除菌。將AST貯存液加入到含FuDR（終濃度為40 μmol/L，該濃度能夠抑制線蟲繁殖且不影響線蟲生長發育和壽命[15]）的NGM培養基中，使其終濃度為120 μmol/L。對照組只加入溶解相應濃度AST所需的等體積的DMSO，應確保所有NGM中DMSO的終濃度均要小于0.2%（v/v）[16]。為了防止E.coliOP50代謝AST改變其生物化學性質，本研究均使用高溫滅活的E.coliOP50菌液涂至NGM表面，且E.coliOP50菌液中也需要使AST終濃度為0或120 μmol/L。

1.2.3 線蟲壽命測定 轉移50條同期化的L4期線蟲到NGM培養基中，在20 °C恒溫恒濕培養箱中培養，每2 d統計一次線蟲的死亡、存活和剔除的數目（為了保證線蟲食物充足，需要2 d更換一次NGM培養基）。線蟲死亡判斷標準：無移動及吞咽動作，輕觸后仍無任何反應。剔除標準：逃離至平皿壁或蓋上而干死；蟲卵在體內孵化而成袋樣蟲；鉆入瓊脂中；生存期定義為：線蟲從L4幼蟲期（Age=0）至其被計數為死亡的時間，重復三次。

1.2.4 RNA提取和qRT-PCR 在AST干預WT線蟲第6 d，用M9緩沖液收集約1000條線蟲。采用Trizol法提取總RNA，UV吸光度（260/280比值）檢查RNA純度。隨后采用SPARK script II RT Kit（思科捷，中國）將RNA逆轉錄為cDNA。qPCR檢測相關基因的mRNA表達，用于qPCR的引物序列見表1。

表1 自噬相關基因mRNA表達測定用引物Table 1 Primers for the determination of autophagy-related gene mRNA expression

采用20 μL qPCR Master Mix（Promega）進行RT-PCR反應，每個樣品3個重復。擴增反應在Roche公司的Lightcycler480 Ⅱ熒光定量PCR儀中完成。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃、10 s變性，60 ℃、30 s退火/延伸，共40個循環；溶解曲線：90 ℃5 s，60 ℃ 31 s。擴增結束后得到Ct值，采用Folds=2-ΔΔCt法計算相對基因表達量。

1.2.5 活性氧自由基ROS測定 ROS 測量根據Schiavi等[17]方法進行。在AST干預WT線蟲第6 d，將線蟲轉移至裝有1 ml DCFH-DA熒光探針（100 μmol/L，溶于M9溶液中）的EP管中，20 ℃孵育30 min。隨后將線蟲轉移至滴加NaN3溶液的瓊脂糖墊上，用倒置熒光顯微鏡拍攝熒光圖片（激發波長485 nm，發射波長530 nm），用Image J軟件測量熒光強度值。每組隨機挑選30條線蟲，重復3次。

1.2.6 Western Blot 在AST干預DA2123線蟲的第6 d用M9緩沖液收集蟲體（每組約1000條線蟲）。加入裂解液后使用超聲儀勻漿提取蛋白，通過BCA蛋白檢測試劑盒（Beyotime）測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離等量蛋白，并轉移到PVDF膜，5% BSA室溫封閉1 h。再加入GFP抗體（1:1000；Abcam）和β-actin抗體（1:1000；CST）4℃封閉過夜。TBST清洗后加相應二抗室溫孵育1 h，TBST清洗后加化學發光顯色底物試劑顯色，并使用ChemiDocTM XRS+成像系統（Bio-Rad，Hercules，CA）進行觀察，Image J 2.0軟件進行定量分析。

1.2.7 胡桃醌氧化應激實驗 AST干預WT線蟲至第6 d，將不同組別培養基上的線蟲轉移到含終濃度為240 μmol/L胡桃醌的NGM培養基中，每組3板，每板50條。每天記錄線蟲的死亡情況，死亡判定標準同壽命測定實驗相同，直至線蟲全部死亡。實驗重復3次。

1.3 數據處理

采用Kaplan-Meier生存分析繪制生存曲線，采用Log-rank分析進行顯著性差異檢驗。兩組間采用t檢驗進行統計學分析，三組或多組之間的比較采用單因素方差分析（ANOVA），采用SNK-q檢驗進行各組間的兩兩比較。平均壽命表示為Mean±SEM，其他數據表示為Mean±SD，P＜0.05為差異有統計學意義。數據錄入使用Excel，所有統計分析均采用SPSS 20.0軟件，使用Prism 7繪圖。

2 結果與分析

2.1 AST對WT線蟲壽命的影響

AST干預后WT線蟲的壽命變化結果見圖1與表2。與對照組0 μmol/L AST相比，AST干預后線蟲的生存曲線右移（圖1），其平均壽命顯著（P＜0.05）延長（表2），表明AST干預能夠延長WT線蟲的壽命。

圖1 AST干預對WT線蟲壽命的影響Fig.1 Effect of AST intervention on lifespan of WT

表2 各組線蟲壽命的統計分析Table 2 Statistical analysis of nematode longevity in each group

2.2 AST對WT線蟲抗氧化和自噬相關基因表達的影響

為了探討AST延長線蟲壽命的效應是否與抗氧化和上調自噬有關，在AST干預的第6 d采用qRT-PCR檢測WT線蟲抗氧化相關基因sod-3和ctl-1和自噬相關基因bec-1和lgg-1的mRNA表達水平。結果顯示，與對照組相比，AST干預組sod-3 mRNA、ctl-1 mRNA、bec-1 mRNA和lgg-1 mRNA水平顯著（P＜0.05）升高（圖2）。結果表明，AST可能通過上調sod-3和ctl-1的表達提高線蟲的抗氧化能力，上調bec-1和lgg-1的表達提高線蟲體內的自噬水平，從而達到延長壽命的作用。

圖2 AST對抗氧化和自噬相關基因表達量的影響Fig.2 Effects of AST on the expression levels of genes related to oxidation and autophagy

2.3 AST對WT線蟲體內的ROS的影響

ROS具有強氧化性，過多的ROS堆積在細胞中會對DNA、脂質、蛋白質等造成損傷，是引起衰老的重要因素之一[18]。通過檢測AST對ROS的影響從而進一步評估其抗衰老的效果。在AST干預的第6 d，熒光探針檢測線蟲體內的ROS水平。如圖3所示，與對照組相比，AST干預組線蟲體內的ROS熒光強度顯著降低（P＜0.05）。實驗結果說明，AST通過清除線蟲體內過多的ROS，改善氧化損傷狀態，從而延長線蟲壽命。

圖3 AST對WT線蟲體內ROS水平的影響Fig.3 Effects of AST on ROS levels in WT nematodes

2.4 AST對DA2123線蟲自噬基因lgg-1的影響

AST在心臟、腎臟、肝臟和肺中均能調控自噬從而調控細胞損傷[11]。DA2123線蟲品系的自噬基因lgg-1標記有綠色熒光蛋白GFP，通過檢測GFP的表達量即可反映線蟲的自噬水平。在AST干預的第6 d，通過Western Blot檢測DA2123線蟲品系中GFP::LGG-1熒光蛋白的表達量。結果如圖4，與對照組相比，AST干預組GFP::LGG-1表達顯著上升（P＜0.05），該結果與PCR結果一致，驗證了AST干預能夠上調線蟲的自噬水平。

圖4 AST干預對DA2123線蟲自噬蛋白表達的影響Fig.4 Effect of AST intervention on the expression of autophagy protein in nematode

2.5 氧化應激條件下AST對WT線蟲自噬水平的影響

研究表明，氧化應激產生的ROS在適宜的水平時可激活自噬[2]。胡桃醌可以在機體內氧化形成半醌自由基，半醌自由基擁有極強的氧化能力，可以迅速將氧分子氧化為超陰離子自由基，再生為胡桃醌，如此往復循環，形成體內氧化應激環境，導致線蟲體內ROS增加[19]。本研究采用胡桃醌誘導線蟲的氧化應激狀態。在干預的第6 d采用qRT-PCR檢測WT線蟲自噬相關基因bec-1和lgg-1的mRNA表達量。結果如圖5所示，與WT+0 μmol/L AST干預組相比，WT+240 μmol/L胡桃醌+0 μmol/L AST干預組bec-1和lgg-1的mRNA表達量均顯著降低（P＜0.05），WT+240 μmol/L胡桃醌+120 μmol/L AST組bec-1和lgg-1的mRNA表達量均顯著升高（P＜0.05）。由該結果可以推測，胡桃醌導致線蟲體內大量的ROS堆積，大量的ROS抑制線蟲自噬。而AST干預能夠緩解線蟲氧化應激狀態（圖5），降低ROS水平，適宜水平的ROS激活了線蟲自噬。

圖5 ROS對自噬相關基因表達量的影響Fig.5 Effect of ROS on the expression of autophagy-related genes

2.6 氧化應激條件下AST對WT線蟲線蟲壽命的影響

本研究進一步探討了在氧化應激環境下AST對線蟲壽命的影響，結果顯示（圖6和表3），與WT+0 μmol/L AST組相比，加入240 μmol/L胡桃醌后WT線蟲的壽命縮短，差異具有統計學意義（P＜0.05），在氧化應激的條件下加入120 μmol/L AST后，線蟲的壽命有所延長，差異具有統計學意義（P＜0.05）。表明AST對胡桃醌導致的氧化損傷具有保護作用。

圖6 氧化應激環境下AST對WT線蟲壽命的影響Fig.6 Effect of AST on the lifespan of WT nematodes under oxidative stress

表3 各組線蟲壽命的統計分析Table 3 Statistical analysis of nematode longevity in each group

3 討論與結論

根據衰老的自由基理論，衰老的原因是由于細胞呼吸過程中產生過量的ROS堆積在細胞內，導致機體處于氧化應激狀態[20]。目前關于AST的抗衰老作用多關注于其抗氧化作用[9-10,21-25]，AST通過調節IIS信號通路相關基因維持細胞內ROS的最佳平衡，從而達到延緩衰老的作用。在本研究的結果也證實了表明AST通過上調抗氧化基因sod-3和ctl-1的表達水平，激活體內抗氧化酶，以抵御機體的氧化損傷。

本研究進一步探討了ROS與自噬在AST抗衰老作用中的相互關系。ROS在信號轉導、基因調節和氧化還原調節等生理方面至關重要，例如，氧化應激狀態產生的ROS能夠激活自噬[4,26]。反過來，自噬可能通過吞噬和降解氧化物質來減少氧化損傷響[26-27]。許多研究都表明了適當的增強自噬水平可以延緩衰老[28-30]。在線蟲中與自噬相關的基因為lgg-1和bec-1。Lgg-1是酵母自噬相關基因8的同源基因（atg-8），在哺乳動物中的同源基因為LC3，位于自噬前體和自噬體的膜表面，參與自噬體的形成，是自噬的重要標志[31]。Bec-1是酵母自噬相關基因（atg-6）的同源基因，在哺乳動物中的同源基因為beclin-1，標志著自噬的開始[32]。結果2.5表明，采用240 μmol/L胡桃醌誘導線蟲氧化應激時，自噬基因bec-1和lgg-1相對表達量顯著減少（P＜0.05），當加入具有強抗氧化作用的AST后，自噬基因bec-1和lgg-1相對表達量顯著增加（P＜0.05，圖5）。因此，本研究推測強抗氧化劑AST能使線蟲體內的ROS維持適宜的水平，進而誘導自噬水平上升，達到其延緩線蟲衰老和延長壽命的作用。相反，上調的自噬通過吞噬和降解氧化物質來減少氧化損傷，清除細胞內堆積的ROS。但是本研究沒有進一步探討自噬水平的改變是否會影響ROS，后續有待進一步探討AST抗衰老效應中ROS與自噬的相互作用。

本研究以秀麗隱桿線蟲為模型，表明AST通過清除線蟲體內過多的ROS堆積，上調其自噬水平，從而延長線蟲的壽命，且AST可能通過調節線蟲體內ROS水平進而調控自噬，研究為抗衰老保健品的開發奠定基礎。