油棕Δ9硬脂酰-ACP脫氫酶EgSAD基因的克隆及表達分析

王夢娣　李 睿　曹紅星　金龍飛　李新國

摘? 要：9硬脂酰-ACP脫氫酶（9 stearoyl-ACP dehydrogenase，SAD）是植物中重要的脂肪酸脫氫酶，在調控不飽和脂肪酸合成中發揮著重要作用。本研究以非洲油棕和雜交油棕為材料，在油棕果實油脂積累期，分別測定花后120、140、160 d 3個時期的脂肪酸組分;從油棕中克隆SAD基因，并對其理化性質、進化關系、啟動子順式作用元件進行生物信息學分析;利用實時熒光定量PCR檢測SAD在2個油棕品種果實成熟期的表達特征。結果表明：非洲油棕中總不飽和脂肪酸（棕櫚酸和硬脂酸）比例（55.76%～60.27%）顯著高于雜交油棕（37.2%～45.43%），雜交油棕中不飽和脂肪酸（油酸和亞油酸）比例（51.61%～56.92%）顯著高于非洲油棕（35.54%～38.64%）;鑒定了7個基因命名為：～和～;基因編碼的肽鏈平均為413個氨基酸，分子量為43.41～45.92 kDa，等電點為5.99～7.13，蛋白不穩定指數為44.07～53.25，總平均親水性為?0.496～?0.405。基因編碼的肽鏈平均為405個氨基酸，分子量為44.94～49.39 kDa，等電點為6.05～7.14，蛋白不穩定指數為43.44～44.61，總平均親水性為?0.554～?0.489。多序列比對分析，油棕SAD基因氨基酸序列中存在典型SAD特征的保守組氨酸富集區：EENRHG和DEKRHE。在SAD的啟動子上鑒定出植物激素響應、逆境脅迫響應、光響應和逆境響應順式作用元件。在油棕果實成熟過程中呈上調表達趨勢，和在雜交油棕中表達量顯著高于非洲油棕，s在雜交油棕果實花后140?d中表達量最高，在雜交油棕的3個時期中均呈現先升高后下降的趨勢，且在花后120?d的表達量顯著高于花后120?d和160?d。本研究結果為進一步研究SAD調控油棕不飽和脂肪酸合成的機制奠定基礎。

關鍵詞：油棕;SAD基因;脂肪酸;生物信息學;基因表達

中圖分類號：Q949.748.5??????文獻標識碼：A

Identification and Expression Analysis of 9 Stearoyl-ACP Desaturase Gene in Oil Palm

WANG Mengdi LI Rui CAO Hongxin ?JIN Longfei ?LI Xinguo

1. College of Horticulture， Hainan University / Key Laboratory of Tropical Horticultural Crop Quality Regulation of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 2 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science / Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339， China

9 Stearoyl-ACP dehydrogenase （SAD）， an important fatty acid dehydrogenase in plants， plays an important role in regulating the synthesis of unsaturated fatty acids. Oil palm is an important woody oil crop in the world. In this study， the saturated fatty acid and unsaturated fatty acid components of African oil palm and hybrid oil palm were determined at 120， 140 and 160 days after flowering （DAF） during the oil accumulation period， 120 to 160 （DAF）. The physicochemical properties， evolutionary relationships and -acting elements of promoters were analyzed through bioinformatics. The expression characteristics of SAD genes in two oil palm varieties at fruit maturity stage were detected using real-time fluorescence quantitative PCR. Physiological measurement results showed that the proportion of total unsaturated fatty acids （palmitic acid and stearic acid） in African oil palm （55.76%?60.27%） was significantly higher than that in hybrid oil palm （37.2%?45.43%）. The proportion of unsaturated fatty acids （oleic acid and linoleic acid） in hybrid oil palm （51.61%?56.92%） was significantly higher than that in African oil palm （35.54%?38.64%）. Seven SAD genes were cloned from oil palm and were named ?and ?The results of physicochemical properties analysis showed that genes encoded a peptide chain with an average of 413 amino acids， a molecular weight of 43.41?45.92 kDa， an isoelectric point of 5.99?7.13， a protein instability index of 44.07?53.25， and a total average hydrophilicity of ?0.496 to ?0.405.?The average peptide chain of genes was 405 amino acids， the molecular weight was 44.94?49.39 kDa， the isoelectric point was 6.05?7.14， the protein instability index is 43.44?44.61， and the total average hydrophilicity is ?0.554 to ?0.489. The conserved histidine rich regions with typical SAD characteristics were EENRHG and DEKRHE in the amino acid sequence of oil palm SAD genes. The results of bioinformatics analysis showed that the Cis-acting elements on plant hormone response， stress response， and light response were identified in the SAD promoter. The expression of was up-regulated during the ripening process of the oil palm fruit. The expression levels of and in the hybrid oil palm were significantly higher than those in the African oil palm. The expression levels of s were the highest in the 140 （DAF） of the hybrid oil palm fruit and the expression level of hybrid oil palm at 120 days after anthesis was significantly higher than that at 120 days and 160 （DAF）. This study would lay a foundation for further study on the unsaturated fatty acids synthesis mechanism of SAD gene in oil palm.

oil palm; SAD gene; fat acid; bioinformatics; gene expression

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.002

油棕是重要的熱帶木本油料作物，其果肉壓榨的棕櫚油廣泛應用于餐飲業、食品工業、化工、機械潤滑和生物能源等領域。棕櫚油的脂肪酸組分主要有棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸，其中飽和脂肪酸含量較高，達48%以上。已有研究結果表明，過量攝取飽和脂肪酸增加帕金森癥和心腦血管疾病的風險，通過遺傳改良培育高不飽和脂肪酸油棕品種，降低棕櫚油的棕櫚酸和軟脂酸等飽和脂肪酸含量，提高油酸、亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸含量，對提升棕櫚油品質和擴大消費市場至關重要。

植物脂肪酸的合成主要在質體中進行，以糖酵解產生的丙酮酸為底物從頭合成，生成16～18個碳的飽和脂肪酸，飽和脂肪酸在脫氫酶的作用下合成不飽和脂肪酸。質體中的硬脂酰酰基載體蛋白（ACP）在9硬脂酰-ACP脫氫酶（stearoyl- ACP desaturase，SAD）的作用下，去飽和生成含油不飽和雙鍵的油酰基ACP，然后在硫酯酶的作用下解離，轉運至內質網進行三酰甘油的組裝，或者繼續延長、脫氫合成其他不飽和脂肪酸。SAD是植物脂肪酸合成中的關鍵節點，是不飽和脂肪酸合成中的關鍵酶，對調節脂肪酸的組分具有重要意義。近年來，在擬南芥、花生、油菜、可可、棉花、大豆和油橄欖等植物中鑒定了編碼SAD。在煙草中超量表達黃羽扇豆的SAD基因，能顯著提高葉片油酸的含量。采用反義鏈降低棉花中SAD的表達量，棉籽油中硬脂酸含量由2%升高到40%。在萊茵衣藻中也發現，采用人工合成miRNA介導基因沉默的方式降低SAD的表達量，與野生型相比，轉基因系的硬脂酸含量增加1倍。研究人員也在非洲油棕中克隆了2個SAD基因，表達分析發現其在果實發育中后期的表達量較高，但對于SAD調控油棕不飽和脂肪酸合成的機制還不明確。隨著油棕基因組數據的公布，基于全基因組數據挖掘功能基因成為可能。本研究在非洲油棕中挖掘了4條，在雜交油棕中挖掘了3條，分析其理化性質、進化關系、啟動子順式作用元件，并采用熒光定量PCR分析其在油棕果實成熟過程中的表達特征，為后續研究SAD基因在油棕的生物學功能和遺傳改良奠定基礎。

? 材料與方法

? 材料

實驗材料采自中國熱帶農業科學院椰子研究所基地（19°33′ N，110°47′ E）。分別采集‘熱油4號’非洲油棕（）和雜交油棕（× ）花后120 d（S1）、140 d（S2）和160 d（S3）的果肉。樣品采集后液氮速凍，儲存在?80℃冰箱中以備RNA提取。

?方法

1.2.1? 油棕脂肪酸含量? 油棕果肉的脂肪酸采用GC-MS色譜法測定。

1.2.2? 油棕SAD基因家族的挖掘與生物信息學分析? 油棕全基因組數據從NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，非洲油棕ID：2669，美洲油棕ID：24188）中下載，擬南芥SAD蛋白質序列從TAIR數據庫（https：//www.arabi-dopsis.org/）中下載。以擬南芥的SAD蛋白質序列作為參考序列，通過BLSATP在油棕基因組數據庫中進行比對。基因全長采用生工生物工程（上海）股份有限公司的高保真PCR Mix預混液克隆。利用在線工具ExPAsy（http：//www.expasy.org）分析油棕SAD基因家族的蛋白質分子量、等電點和總平均親水性等理化性質。從NCBI數據庫中下載油棕SAD基因CDS上游2000 bp的序列，利用Plant Care進行順式作用元件分析，采用Tbtool進行可視化分析。使用在線分析工具 Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/ clu-stalo/）比對油棕SAD基因編碼氨基酸序列，使用在線工具 BoxShade顯示比對結果（http：// www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）。

1.2.3 ?RNA提取及基因表達分析 ?油棕果肉的總RNA提取采用生工生物工程（上海）股份有限公司的Spin Column Plant Total RNA Purification Kit試劑盒，cDNA合成采用北京全式金生物技術有限公司的HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒進行，具體步驟參照試劑盒的說明書。實時熒光定量PCR采用賽默飛世爾科技（中國）有限公司的SYBR Select Master Mix進行分析，以β-actin作為內參基因，反應體系參照試劑盒的說明書，設置3個生物學重復，引物見表1，采用2法計算目標基因的相對表達量。

? 數據處理

采用SPSS 26.0軟件進行數據分析，用Duncan’s檢測法進行脂肪酸含量和基因表達的差異顯著性分析。

?結果與分析

?油棕果肉的主要脂肪酸種類和含量

由表2可知，油棕果肉的主要脂肪酸種類有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、和亞油酸，月桂酸、豆蔻酸、亞麻酸等含量較低歸入其他類，非洲油棕中不飽和脂肪酸（棕櫚酸和硬脂酸）比例（55.76%～ 60.27%）顯著高于雜交油棕（37.2%～45.43%），雜交油棕中不飽和脂肪酸（油酸和亞油酸）含量比例（51.61%～56.92%）顯著高于非洲油棕（35.54%～38.64%）。

油棕基因的克隆、編碼蛋白質的理化性質分析及亞細胞定位預測

通過BLASTP比對在非洲油棕和美洲油棕的基因組中鑒定了7個SAD候選蛋白質，根據其與擬南芥的同源性順序進行命名，依次命名為～、～。分別以油棕果實和雜交油棕果實的cDNA為模板，克隆

SAD基因（圖1）。基因長度為1165 bp，編碼471個氨基酸;基因長度為1179 bp，編碼393個氨基酸;基因長度為1173 bp，編碼391個氨基酸;基因長度為1197 bp，編碼399個氨基酸;基因長度為1038 bp，編碼393個氨基酸;基因長度為999 bp，編碼393個氨基酸;基因長度為1173 bp，編碼430個氨基酸。非洲油棕EgSAD1～EgSAD4蛋白質不穩定系數分別為45.38、44.07、48.11和53.25;總平均親水性為?0.405、?0.496、?0.450和?0.453。雜交油棕OeSAD1～OeSAD3蛋白質不穩定系數分別為44.07、43.44和44.61;總平均親水性為?0.500、?0.489和?0.554（表3）。

?非洲油棕和雜交油棕的進化分析

將油棕的SAD蛋白序列與其他作物進行同源性比對，并采用MEGA 6.0進行進化關系分析。結果發現，EgSAD1和AtSAD1、TcSAD5聚在一起，EgSAD2、EgSAD3、EgSAD4、OeSAD1、OeSAD2、OeSAD3和TcSAD9聚在一起（圖2）。

?啟動子順式作用元件的鑒定

在非洲油棕和雜交油棕SAD基因的啟動子中鑒定出7種順式作用元件（圖3），其中包含光響應（25個）、茉莉酸甲酯響應（4個）、脫落酸響應（8個）、逆境響應（2個）、干旱響應（4個）、水楊酸響應（4個）和赤霉素響應（1個）。

油棕蛋白氨基酸序列比對

由圖4可知，油棕SAD蛋白氨基酸序列中存在典型的保守組氨酸富集區：EENRHG和DEKRHE（圖4中的紅色框），天冬氨酸（D）和組氨酸（H）為催化活性中心的二價鐵離子提供結合位點，保證了油棕SAD脫氫酶具有一定的催化活性。

? 油棕基因的表達特征分析

采用實時熒光定量PCR對4個基因和3個基因分別在非洲油棕和雜交油棕花后120、140、160?d的果中進行表達特征分析（圖5）。基因在2個品種中的表達量隨著果實發育時期逐漸增加，在花后140?d和160 d，基因在雜交油棕種中的表達量顯著高于非洲油棕。基因在2個品種中均有表達，且在雜交油棕種中的表達量顯著高于非洲油棕。基因在非洲油棕花后160?d的表達量顯著高于花后120 d和140 d，在雜交油棕中僅在花后120 d時有少量表達。基因在非洲油棕和雜交油棕中均有表達，但在非洲油棕中的表達量顯著高于雜交油棕。、和基因在雜交油棕的3個時期中均呈現先升高后下降的趨勢，且在花后120?d的表達量顯著高于花后120?d和160?d。

? 討論

油棕是重要的熱帶油料作物，產油效率極高，但棕櫚油中主要是飽和脂肪酸，過量攝取有增加患心腦血管疾病的風險。因此，降低油棕中飽和脂肪酸含量，提高油酸、亞油酸和亞麻酸等不

飽和脂肪酸含量的比例，對提升棕櫚油品質至關重要。SAD主要在質體中催化與ACP結合的硬脂酸或軟脂酸的9號和10號碳原子之間去飽和形成油酸，在植物細胞不飽和脂肪酸的合成中發揮重要作用。本研究在非洲油棕和雜交油棕中克隆了7個SAD基因，并初步探究了SAD的功能。MANUEL 等研究發現亞麻薺和澳洲堅果中的SAD是可溶性酶。在本研究中，7個基因總平均親水性均為負值，表現為親水性。典型SAD含有特征的保守組氨酸序列富集區：EENRHG和DEKRHE。多序列比對結果顯示，油棕SAD蛋白氨基酸中含有特征的保守組氨酸，保證脫氫酶具有催化活性。進化分析結果發現，油棕的SAD基因與可可的SAD聚在一起，可能是因為油棕和可可都是熱帶木本油料作物，有著相似的進化關系。

油棕果實脂質積累主要在成熟期，從花后120?d開始迅速積累，在花后160?d達到峰值。因此，本研究分析了7個SAD基因在油棕果實花后120、140、160?d的表達特征，發現在非洲果實成熟過程中表達逐漸升高，在花后160 d表達量最高，這一結果與油棕本身油脂積累規律一致。在油茶種子發育過程中油酸含量持續上升，SAD基因持續高表達。在油橄欖果肉油脂快速積累期，2個SAD基因的表達量達到峰值。在本研究中，7個SAD基因在油棕果肉成熟期均呈逐漸升高或者先增高后降低的趨勢，這表明SAD基因在油棕油脂快速積累期起重要的調控作用。在山核桃中，研究發現基因的表達與油酸含量密切相關，隨著山核桃油酸含量上升，基因表達上升，山核桃不飽和脂肪酸比例增加。在本研究中，雜交油棕的不飽和脂肪酸含量顯著高于非洲油棕，和在雜交油棕中的表達量顯著高于非洲油棕，同時雜交油棕還存在3個來自于美洲油棕親本的。進而推測雜交油棕的不飽和脂肪酸高的原因可能是由于SAD基因的高表達。油棕果肉發育的不同階段也受不同激素的調控，本研究也對和啟動子順式作用元件進行預測和分析，發現包含逆境響應、脫落酸響應、茉莉酸甲酯響應等在內的7種順式作用元件。已有研究發現，菊花在鹽脅迫下SAD基因表達量升高，并且伴隨飽和脂肪酸含量的減少和不飽和脂肪酸含量的升高，推測在油棕不飽和脂肪酸的積累也受到激素或非生物逆境的影響。

本研究從油棕中克隆出7個SAD基因，通過生物信息學和表達分析發現油棕SAD基因在油棕不飽和脂肪酸合成中發揮作用，為提高油棕的不飽和脂肪酸含量并改良油棕提供了思路。SAD基因在油棕不飽和脂肪酸合成中的功能和逆境響應作用機制有待進一步研究，后續可通過基因過表達和基因敲除等實驗進行驗證。

參考文獻

1. KAZAZ S， BARTHOLE G， DOMERGUE F， ETTAKI H， TO A， VASSELON D， DE V D， BELCRAM K， LEPINIEC L， BAUD S. Differential activation of partially redundant 9 stearoyl-ACP desaturase genes is critical for omega-9 monounsaturated fatty acid biosynthesis during seed development in [J]. The Plant Cell， 2020， 32（11）： 1-25.
2. KACHROO A， SHANKLIN J， WHITTLE E， LAPCHYK L， HILDEBRAND D， KACHROO P. The stearoyl-acyl carrier protein-desaturase family and the contribution of leaf isoforms to oleic acid synthesis[J]. Plant Molecular Biology， 2007， 63（2）： 1-16
3. 東金玉， 萬勇善， 劉風珍. 花生9-硬脂酰-ACP脫氫酶基因（SAD）的序列分析[J]. 作物學報， 2012， 38（7）： 1167-1177.DONG J Y， WAN Y S， LIU F Z. Analysis of 9-stearoyl- ACP dehydrogenase gene in peanut[J]. Acta Agronomica Sinica， 2012， 38（7）： 1167-1177. （in Chinese）
4. 賈艷麗， 吳? 磊， 盧長明. 甘藍型油菜9硬脂酰ACP脫氫酶（SAD）基因的克隆與表達分析[J]. 中國油料作物學報， 2014， 36： 135-141.JIA Y L， WU L， LU C M. Cloning and expression analysis of 9 stearyl ACP dehydrogenase （SAD） gene in [J]. Chinese Journal of Oil Crops， 2014， 36： 135-141. （in Chinese）
5. ZHANG Y， MAXIMOVA S N， GUILTINAN M J. Characterization of a stearoyl-acyl carrier protein desaturase gene family from chocolate tree， L.[J]. Frontiers in Plant Science， 2015， 6： 239.
6. 鄧咪咪， 劉寶玲， 王志龍， 薛金愛， 張紅梅， 李潤植. 大豆硬脂酰-ACP Δ9脫氫酶（）基因家族的鑒定及功能分析[J]. 生物工程學報， 2020， 36（4）： 716-731.DENG M M， LIU B L， WANG Z L， XUE J A， ZHANG H M， LI R Z. Identification and functional analysis of soybean stearoyl-ACP Δ9 dehydrogenase （） gene family[J]. Biological Engineering Journal， 2020， 4（4）： 716-731. （in Chinese）
7. KNUTZON D S， THOMPSON G A， RADKE S E， JOHNSON W B， KNAUF V C， KNDL J C. Modification of seed oil by antisense expression of a stearoyl-acyl carrier protein desaturase gene[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1992， 89（7）： 2624-2628.
8. JAEGER L D， SPRINGER J， WOLBENS E J H， MARTENS D E， EGGINK G， WIJFFELS R H. Gene silencing of stearoyl-ACP desaturase enhances the stearic acid content in [J]. Bioresource Technology， 2017， 245： 1616-1626.
9. AKMAR A， CHEAH S C， AMINAH S. Characterization and regulation of the oil palm （） stearoyl-ACP desaturase genes[J]. Journal of Oil Palm Research， 1999： 1-17.
10. SHAH F H， RASHID O， SAN C T. Temporal regulation of two isoforms of cDNA clones encoding delta 9-stearoyl-ACP desaturase from oil palm （）[J]. Plant Science， 2000， 152（1）： 27-33.
11. KRUTKAEW V， SRIRAT T. Cloning and characterization of stearoyl-ACP desaturase gene （SAD） in oil palm （Jacq.）[J]. Thai Journal of Genetics， 2013， 6（1）： 60-64.
12. MANUEL F R， ALICIA S G， JOAQUIN J S， RAFAEL G， ENRIQUE M F. Characterization of soluble acyl-ACP desaturases from ， and [J]. Journal of Plant Physiology， 2015， 178： 35-42.

13. 收稿日期 2021-08-12;修回日期 2021-09-19

    基金項目 中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項資金（No. 1630152021004）。

    作者簡介 王夢娣（1996—），女，碩士研究生，研究方向：熱帶木本油料作物遺傳育種。*通信作者（Corresponding auther）：

    金龍飛（JIN Longfei），E-mail：jlf_0511@163.com;李新國（LI Xinguo），E-mail：lixinguo13@163.com。