橡膠樹1981’IRRDB野生種質預割誘導次生乳管分化的比較分析

史敏晶　張世鑫　晁金泉　李言　鄧小敏　胡彥師　田維敏

摘? 要：巴西橡膠樹樹干樹皮中的次生乳管是天然橡膠合成和貯存的主要組織，次生乳管列的多少與膠乳產量密切正相關。割膠是天然橡膠生產中的核心環節，是當前獲得天然橡膠的唯一途徑，而割膠傷害能誘導次生乳管分化。采用碘-溴染色方法和石蠟切片技術，觀察預割前后1981’IRRDB野生種質成齡樹的樹皮結構，對不同種質預割前后黃皮層和水囊皮區域的乳管列進行統計，并分析新分化的次生乳管列。研究結果表明，選取的85份8年生野生種質在自然條件下的乳管分化能力普遍較弱，黃皮層和水囊皮中成列的次生乳管數量均較少，2個部位合計乳管列數普遍低于8列。預割后不同種質水囊皮中次生乳管列數普遍增多，但黃皮層尚無明顯變化。根據傷害誘導分化新的次生乳管列數的多少，將預割誘導乳管分化的能力由低到高分為1、2、3級，分別對應于新分化乳管列數為少于2列、2～3列（含2列）、3～4列（含3列）。在85份種質中，對應1級57份、2級23份、3級5份的種質，所占比例分別為67.06%、27.06%、5.88%，可見，誘導分化次生乳管能力強的種質占比較低，大部分種質為1、2級乳管分化，3級分化能力的種質極少。被誘導新分化次生乳管的能力與種質在自然條件下的分化能力有關，尤其是高乳管分化能力的種質通常在自然條件下也有較強的分化乳管的能力。通過預割判斷乳管分化能力不僅為野生種質鑒定和評價奠定基礎，也為橡膠樹高產育種以及早熟、晚熟品種的早期預測提供有效指標。

關鍵詞：橡膠樹;野生種質;預割;次生乳管分化

中圖分類號：S794.1??????文獻標識碼：A

Comparison of Secondary Laticifer Differentiation of Mature Tree Induced by Pre-tapping in 1981’ IRRDB Wild Germplasm of Rubber Tree

SHI Minjing ZHANG Shixin CHAO Jinquan ?LI Yan DENG Xiaomin HU Yanshi TIAN Weimin

Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation and Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 570100， China

The secondary laticifer in the trunk bark of a rubber tree （ Muell. Arg.） is the major tissue to synthesize and store natural rubber. The number of secondary laticifer rows in the bark has a significantly positive correlation with the latex yield. Tapping is the key step in natural rubber production and the unique way to acquire the natural rubber， and the differentiation of the secondary laticifer can be induced by tapping. Using iodine-bromine reagent dying and paraffin section technology， the bark structure of 1981’ IRRDB wild germplasms before and after pre-tapping was observed under an optical microscope. The number of the secondary laticifer rows in the yellow skin layer and water sac skin layer of 1981’IRRDB wild germplasms was recorded， further the differentiation of the secondary laticifer was analyzed. In the 85 wild germplasms accessions， there was a low number of secondary laticifer rows in the yellow skin layer and water sac skin layer respectively under natural conditions. Usually the total number of secondary laticifer rows in both yellow skin and water sac skin layer was less than 8 rows for 8 years of rubber trees. After pre-tapping， the number of secondary laticifer rows in the water sac skin layer generally increased， but there was no significant change in the yellow skin layer. According to the number of new secondary laticifer rows induced by pre- tapping， the differentiation ability of secondary laticifer from low to high was roughly classified into 3 grades （Grade 1， Grade 2 and Grade 3）， corresponding to the number of new laticifer less than 2， between 2 to 3 （including 2）， and between 3 to （including 3）， respectively. Based on the criteria， there were 57， 23 and 5 accessions corresponding to Grade 1， 2 and 3， with the percentage of 67.06%， 27.06% and 5.88% among the 85 accessions respectively. Therefore， the secondary laticifer differentiation ability in most of the wild germplasms was relatively low. In short， the ability of secondary laticifer differentiation induced by pre-tapping was usually correlated with the natural differentiation ability of germplasm. Germplasms of high differentiation ability induced by pre-tapping always have a strong differentiation ability of secondary laticifer under natural conditions. The ability of secondary laticifer differentiation induced by pre-tapping can be used as an effective indicator for early prediction of high-yield and peak yielding period， and the results also would provide a basis for identification and evaluation of the wild germplasm resources for rubber tree.

Muell. Arg.; wild germplasm; pre-tapping; secondary laticifer differentiation

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.010

巴西橡膠樹（以下簡稱橡膠樹）是人工栽培最重要的一種產膠植物，提供了世界所需98%以上的天然橡膠。橡膠樹中的天然橡膠是一種順式-聚異戊二烯次生代謝物，于膠乳中提煉而成，因其具有合成橡膠不可媲美的綜合性能，在醫療、航天、航海、重型汽車等領域的應用具有不可替代性。乳管細胞是產生和貯藏膠乳的一種特化次生代謝組織，乳管數量的多少與天然橡膠產量的高低密切相關，因此，對乳管的研究一直是橡膠樹產膠生物學研究中的重點。

橡膠樹的種子、葉、花、果實、根以及莖中都分布有貯存天然橡膠的乳管，但由于橡膠樹迥異于其他農作物收獲產品的方式（割膠，即切割樹干樹皮，是當前收獲膠乳的唯一方式），分布于樹干中的次生乳管是提供膠乳的最主要來源，因此，其數量是當前決定天然橡膠產量的關鍵因素。橡膠樹樹干中的次生乳管是由維管形成層中的紡錘狀原始細胞切向分裂形成的，與形成層呈同心圓狀排列，次生乳管分化的能力是橡膠樹種質固有的特征，也受環境、機械傷害以及激素等多種因素的影響。研究表明，割膠造成的機械傷害和排膠都能誘導成齡樹樹干次生乳管分化，其中排膠起主要作用。對7～8齡橡膠樹預割，既造成機械傷害也導致了排膠，經證明也能誘導次生乳管分化。和針對3～4齡橡膠樹的試割相比，預割針對的是即將正式開割的大樹。分析不同成齡樹種質在預割傷害后次生乳管的分化特征，能更有效地預測正式割膠后橡膠樹的乳管分化情況，為有效篩選出具有高產潛能的種質提供依據。

1981’IRRDB野生種質引自巴西亞馬孫河流域地域相隔較遠的朗多尼亞州（RO/）、阿克里州（AC/）和馬托格羅索州（MT/），與采集區域相對狹窄的魏克漢種質相比，具有更為廣泛的遺傳基礎，是我國重要的種質資源，對該種質的主要性狀進行鑒定、評價是選育種的重要基礎。目前，相對馴化約150年的魏克漢種質，1981’ IRRDB野生種質的馴化利用基本處于空白。我國先后引進了7500多份野生種質，由于其群體數量大，故鑒定、評價工作進展較緩慢。次生乳管分化能力作為影響膠乳產量最主要的因素之一，分析野生種質成齡大樹在預割傷害后次生乳管分化的特征，不僅為鑒定和評價野生種質提供依據，也為成齡大樹割膠后乳管分化的能力提供早期預測，這對于縮短橡膠樹產量育種時間和提高育種效率具有重要的應用價值。

? 材料與方法

? 材料

1.1.1? 試驗材料? 選取種植于中國熱帶農業科學院儋州試驗場三隊（海南儋州寶島新村）8年生1981’IRRDB野生種質85份（表1），于當年8月距地面高2?m處，以1/4樹圍開割線，并同時采集割線上垂線處樹皮1份作為對照。按照3?d

1刀的割制，陰刀連續割膠10刀，然后停割1個月，在割線上垂線位置再采集樹皮1份。樹皮材料經80%酒精固定后，碘-溴染色處理，制備石蠟切片。

1.1.2? 主要試劑和儀器? 制備石蠟切片所需的乙醇、正丁醇、冰醋酸、二甲苯為國產分析純，石蠟為生物組織切片專用。切片機為Leica RM2235型旋轉切片機，成像顯微鏡為德國Leica DMLB型光學顯微鏡。

? 方法

光學顯微切片的制備：材料采集后分割，并經80%（/）乙醇固定24?h，乙醇梯度脫水，碘-溴冰醋酸試劑60℃處理48?h，乙醇脫水后經正丁醇透明，石蠟包埋，具體參見史自強等方法并稍作修改。樹皮橫切，切片厚度15?μm，二甲苯脫蠟后固綠染色1?h，中性樹膠封片。

? 數據處理

光學顯微鏡下觀察橫切面切片并成像。光鏡下統計每份切片材料黃皮層和水囊皮層中的乳管列數，對比預割前后的結果，分析新生的次生乳管分化列數情況，采用Excel 2003軟件制作圖表。

? 結果與分析

? 橡膠樹野生種質自然條件下次生乳管的分化

對85份8年生的野生種質大樹的原生樹皮進行切片觀察。結果表明，不同種質水囊皮厚度存在明顯差異，范圍分布在200～1000?μm之間，但大部分種質水囊皮厚度在500?μm左右。水囊皮中的乳管為幼嫩乳管，不同種質中分化的列數不同（圖1A），其中，56份種質僅1列乳管，占總種質數量的65.88%;12份種質中有2列乳管，占14.12%;10份種質的水囊皮中未觀察到乳管列，占11.76%;6份種質中有3列乳管，占7.06%;僅1份種質中有4列乳管，占1.18%。由此可見，自然條件下，野生種質水囊皮中的乳管列數普遍偏低，2列及以下乳管列數的種質占比高達91.76%，而3列及以上列數的種質占比僅8.24%。水囊皮通常在一年半至兩年內形成，由此可以推測出野生種質在一年內形成的次生乳管數量通常是極少的。

黃皮層緊鄰水囊皮的外側，作為主要的產膠區域，次生乳管為成熟乳管。8年生的野生種質中黃皮層較薄，厚度在500～1200?μm之間，其中，厚度在700?μm左右的種質較多。黃皮層中的次生乳管列數不同種質差異較大，從1至7列皆有。綜合分析水囊皮和黃皮層中成列的次生乳管列總數量（圖1B），其中4列及以下的種質數量為58份，占68.24%;5～7列的種質數量為24份，占28.23%;8列以上的種質數量極少，僅3份，占比為3.53%。

8年生野生種質的砂皮內層不明顯，大部分種質中石細胞出現后即形成石細胞列，次生乳管被擠壓而分散，很少觀察到成列的乳管。

? 預割誘導橡膠樹野生種質次生乳管的分化

對野生種質大樹的樹干進行預割處理后，切片觀察樹皮中次生乳管分布的情況。預割后不同種質水囊皮的厚度普遍有所減少，這與割膠傷害到水囊皮有關。不同種質水囊皮中的幼嫩乳管列數普遍增加（圖2A），其中，水囊皮中有2列乳管的種質數量為39份，占45.88%;含1列乳管的種質數量為25份，占29.41%;含3列乳管的種質有12份，占14.12%;含4列乳管的種質有7份，占8.23%;含5列和6列乳管的種質各1份，占比合計為2.36%。與預割前比較，水囊皮中都觀察到至少1列的乳管，且含3列以及更多列乳管的種質數量明顯增多，占總種質數量比為24.71%，遠高于預割前的8.24%。

預割后的黃皮層厚度變化不明顯，但是零散的石細胞出現的位置更靠近樹皮內側。黃皮層的成熟乳管隨著樹皮的生長，逐漸外移進入砂皮內層，而水囊皮的幼嫩乳管也隨著生長進入黃皮層成為成熟的乳管，經比較分析，不同種質在預割前后，黃皮層中次生乳管的列數并未出現明顯的變化，這與取樣時間與預割處理的時間間隔太短有關。綜合分析水囊皮和黃皮層中次生乳管列的數量（圖2B），其中4列以下的種質數量為45份，占52.90%;5～7列的種質數量為33份，占38.80%;8列以上的種質數量增加至7份，占8.30%。不同種質中乳管列數量普遍增加的結果應與預割誘導水囊皮中分化新的乳管相關。與預割前比較，砂皮層的結構以及乳管的分布無明顯變化。

由于采樣時間與第一刀預割割膠傷害的時間間隔僅為2個月，而次生乳管形成到脫離水囊皮需要至少一年的時間，因此新形成的乳管列距形成層較近，而預割前自然形成的乳管列相對遠離形成層，在新乳管列的外側。通常，新誘導的乳管列有密集趨勢，間隔的薄壁細胞層數少，而自然形成的乳管列之間間隔的細胞層數較多，間距較遠。對預割前后水囊皮和黃皮層中的乳管列特征進行比較分析，可以計算出預割誘導的新分化乳管列數。結果表明，不同的野生種質在預割期間新形成的次生乳管列數不同，具有明顯的種質特征（圖3）。根據新形成次生乳管列數的多少，將預割誘導的乳管分化能力分為1、2、3級，分別對應于新分化乳管列數少于2列、2～3列（含2列）、3～4列（含3列）。根據這一分級標準，在85份野生種質中，1級分化的種質有57份，占67.06%;2級分化的種質有23份，占27.06%，二者合計為94.12%，可見大部分種質的乳管分化能力處在較弱的1級和2級。分化出3列及以上次生乳管的被認為具有較好的乳管分化能力，3級分化的種質有5份，占5.88%，可見分化能力強的種質占比極低（圖4A）。

自然條件下黃皮層和水囊皮中成列次生乳管列數少的種質，預割后被誘導分化次生乳管的能力通常也較低。統計表明，1級分化能力的種質主要來自于自然條件下黃皮層和水囊皮中次生乳管列數不超過4列的種質，計46份，比例高達80.70%，余下的19.30%來自自然條件下黃皮層和水囊皮具5～7列次生乳管的種質;具有2級分化能力的種質52.17%來自自然條件下黃皮層和水囊皮中次生乳管列數不超過4列的種質，47.83%來自于次生乳管列數5列及以上的種質;而3級分化能力的種質均來自于次生乳管列數5列及以上的種質。可見，自然條件下分化次生乳管列數多的種質通常也表現出較好的誘導效果（圖4B）。

?討論

橡膠樹育種一直以來都是以膠乳產量這一綜合性狀來篩選種質的優劣，而不是按照產膠量相關構成性狀來篩選雜交組合，導致育種周期長，雜交后代篩選工作量大，并很難獲取大幅度超親的品種。隨著研究的進展，人們發現影響膠乳產量的3個關鍵因素是樹干樹皮中的次生乳管列數量、兩次割膠之間的膠乳再生能力以及排膠時間長短，其中，次生乳管列數量是決定天然橡膠產量的最關鍵因子。次生乳管是由維管形成層分化而來，因此，一個種質的樹干形成層分化乳管能力的強弱又決定著乳管列的數量。如何在早期預判一個種質的次生乳管分化能力強弱，進而篩選出具有高產潛能的種質對于縮短橡膠樹選育種年限、提高育種效率具有重要的意義。

為了對橡膠樹的乳管分化能力進行早期的鑒定，田維敏等通過機械傷害誘導幼嫩萌條分化次生乳管，模擬割膠2年生幼樹、試割誘導3～4齡的幼齡樹誘導分化次生乳管，對處在不同年齡段的幼齡橡膠樹種質進行了次生乳管分化能力的分析，結果都表明，傷害誘導次生乳管分化的能力在不同種質中存在明顯差異，是橡膠樹種質本身的遺傳特性。由于橡膠樹產膠存在早熟、晚熟等不同的特性，分析不同種質在不同年齡段割膠傷害后乳管分化的特征，可避免育種中晚熟高產種質的漏選。對與常規割膠樹狀態接近的8齡樹進行預割，分析預割誘導次生乳管分化的能力，可為橡膠樹天然橡膠生產中在不斷的割膠傷害下次生乳管的分化能力提供科學的預判，同時進一步完善乳管分化能力的早期鑒定方法。

本研究對85份野生種質8齡大樹進行了預割，發現不同的種質對預割傷害的反應不同，具有種質特征。傷害后2個月內，大部分種質只能分化出1～2列的次生乳管，占所有種質的94.12%以上;能分化出3列及以上乳管的種質占比僅5.88%，可見，在乳管分化這一性狀上表現很好的種質只有少數。由預割前水囊皮中的次生乳管列數量可知，1～2年內約65%的野生種質通常只能分化出1列次生乳管，而預割能在2個月內誘導新分化出至少1列次生乳管，可見，割膠具有明顯的加快野生種質次生乳管分化的能力。史敏晶等在同期也對8年生魏克漢種質進行了預割誘導乳管分化實驗（結果已投稿），發現魏克漢種質的次生乳管誘導效果普遍優于野生種質，這可能與魏克漢種質經過了100多年的人工馴化、定向選擇高產種質有關。因為根據膠乳產量進行的選擇育種，必然會對決定產量的關鍵因素乳管分化能力這一性狀也進行了一定的篩選。

1981’IRRDB野生種質主要來自朗多尼亞州（RO/）、阿克里州（AC/）和馬托格羅索州（MT/）三大州。本次研究中來自馬托格羅索州（MT/）的15份種質中有4份具有3級乳管分化能力，占據3級分化能力種質的80%;而來自朗多尼亞州（RO/）的41份種質中僅1份具有3級乳管分化能力，由此推測來自馬托格羅索州（MT/）的橡膠樹野生種質可能具有更好的乳管分化潛能。探險家亨利·魏克漢在亞馬孫河流域采集橡膠樹種質的區域在上述3個州中恰好是距離馬托格羅索州（MT/）更近，由此推測高產的魏克漢種質與來自馬托格羅索州（MT/）的野生種質的親緣關系更近。金華斌等對1981’IRRDB野生種質苗期的初生乳管分化能力進行分析，其中來自朗多尼亞州（RO/）的種質表現更好，可見，從選種的角度來看，針對灌木化栽培需要初生乳管分化能力強的種質則可能主要考慮朗多尼亞州 （RO/），而針對成齡樹采膠需要次生乳管分化能力強的種質則可能主要選擇馬托格羅索州（MT/）。野生種質的遺傳背景富于多樣性，對野生種質次生乳管分化能力的鑒定和評價可為橡膠樹高產育種優良親本的篩選提供更為廣泛的選擇。

致謝? 本研究所用橡膠樹種質均由中國熱帶農業科學院橡膠研究所國家橡膠樹種質資源平臺提供。

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14. 收稿日期 2021-07-26;修回日期 2021-10-28

    基金項目 國家重點研發計劃課題（No. 2018YFD1000502）;國家自然科學基金項目（No. 31800577，No. 31870590）;現代

    農業產業技術體系建設專項（No. CARS-33-YZ1）。

    作者簡介 史敏晶（1974—），博士，研究員，研究方向：植物形態結構與發育。*通信作者（Corresponding author）：田維敏

    （TIAN Weimin），E-mail：wmtian@163.com。