云南大理油棕自交子一代對低溫脅迫的生理響應及抗寒性評價

程秋如　劉子凡　曾憲海　曾精　楊宗明

摘? 要：低溫是限制油棕生長發育和產量的重要影響因子，探究低溫條件下油棕的生理響應機制，為油棕耐寒種質資源的選育及推廣提供理論依據。以云南大理抗寒高產油棕成齡樹的自交F代有性系苗木為試驗材料，在4℃低溫脅迫下處理0（對照）、1、3、5 d，根據葉片寒害程度及其恢復生長情況將其劃分為4個寒害等級，即1級（無）、2級（輕）、3級（中）、4級（重），然后測定不同寒害等級油棕葉片的丙二醛含量（MDA）、脯氨酸含量（Pro）、可溶性糖含量（SS）、過氧化物酶活性（POD）和超氧化物歧化酶活性（SOD），并采用隸屬函數法對不同寒害等級油棕材料進行抗寒性綜合評價。結果表明，云南大理抗寒油棕自交F1代的所有植株在低溫處理期間均無寒害癥狀，但在恢復生長階段逐漸表現出不同程度的寒害癥狀;低溫脅迫下，4個寒害等級油棕葉片的各項生理指標在不同寒害等級材料之間、不同脅迫處理時間之間存在顯著差異;隨著低溫脅迫時間的延長，油棕葉片的MDA、Pro、SS含量和SOD活性均不斷升高，POD活性則呈波動性降低;較輕寒害等級材料的MDA含量顯著低于較高寒害等級材料（<0.05），較輕寒害等級材料的SOD活性顯著高于較高寒害等級材料（<0.05），認為MDA和SOD可作為油棕抗寒性評價的參考指標;不同寒害等級材料的隸屬函數法抗寒性評價結果為：1級>2級>3級>4級，隸屬函數綜合評價結果與低溫脅迫后植株葉片寒害程度及其恢復生長情況的觀測一致，說明隸屬函數法在油棕抗寒性評價中具有一定的準確性和可行性。

關鍵詞：油棕;抗寒性;恢復生長;生理指標;隸屬函數法

中圖分類號：S565.9??????文獻標識碼：A

Physiological Response under Low Temperature Stress and Evaluation on Cold Tolerance in Inbreding F1 Group of Oil Palm （ Jacq.） in Dali， Yunnan Pronvince

CHENG Qiuru LIU Zifan ZENG Xianhai ?ZENG Jing YANG Zongming

1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Danzhou Oil Palm Germplasm Resource Garden， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Danzhou Investigation & Experiment Station of Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571737， China

Low temperature is an important factor that restricts the growth and production of oil palm. To investigate the physiological response mechanisms of oil palm under low temperature stress would provide a theoretical basis for breeding and extension of cold resistance oil palm germplasm resources. The inbreding F generation seedlings of a mature oil palm tree with high-yielding and cold resistance in Dali，Yunnan Province were used as the test materials to low temperature stresses of 4℃ for 0 （control）， 1， 3， and 5 days and divided into four cold injury levels depending on the degree of leaf cold damage and the recovery of leaf growth， which were level 1 （none-damaged）， level 2 （light-damaged）， level 3 （moderate-damaged）， and level 4 （severe-damaged）. Furthermore， the content of malondialdehyde （MDA）， content of proline （Pro）， content of soluble sugar （SS）， peroxidase （POD） activity and superoxidase dismutase （SOD） activity was determined for each cold injury level and used for the comprehensive evaluation of cold tolerance of different cold injury level oil palm materials with the membership function method. All plants of the inbreding F generation seedlings of mature oil palm tree with cold resistance in Dali，Yunnan Province did not have obvious cold injury symptoms during the low temperature treatment period， but gradually showed different degrees of cold injury symptoms at the recovery of leaf growth. The physiological indicators of four cold injury level oil palm leaves were significantly different among the cold levels and stress times under low temperature stresses. The content of MDA， Pro， SS and SOD activity gradually increased with the extension of low temperature stress time， while the POD activity fluctuantedly decreased. The content of MDA at lighter cold level was significantly lower than that at higher cold level （<0.05）. SOD activity at lighter cold level was significantly higher than that at higher cold level （<0.05）. Thus MDA and SOD could be used as references index for the cold resistance evaluation of oil palm. The membership function method could be used for the comprehensive evaluation on different cold tolerance materials and the result was level 1> level 2> level 3> level 4， which was consistent with the observation of the degree of leaf cold damage and the recovery of growth under low temperature stresses. It show that membership function method has certain accuracy and feasibility in cold tolerance evaluation of oil palm.

oil palm; cold resistance; recovery of growth; physiological indicators; membership function method

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.013

油棕（ Jacq.）是重要木本油料作物，單產和總產均世界第一，被美譽為“世界油王”。油棕原產于熱帶西非，目前主要分布在南緯10°至北緯15°的56個熱帶亞非拉太國家和地區，喜高溫多雨的氣候，適宜生長溫度為24～27℃，低于15℃生長受到影響。前期調查表明，我國海南、云南、廣東、廣西、福建5省（區）均有油棕分布，除海南南部以外，我國其他熱區地處熱帶邊緣，熱量遠低于油棕原產區，并經常遭遇低溫侵襲，尤其是極端低溫，對油棕生長發育造成嚴重威脅。因此，建立適宜的抗寒評價方法并應用于抗寒油棕種質資源的篩選，對我國熱帶北緣油棕發展具有現實意義。

近年來，對油棕抗寒生理鑒定已有較多報道，在低溫脅迫下油棕葉片的生理生化指標會發生明顯的變化，其抗寒能力與滲透調節物質和抗氧化酶等指標密切相關。曹建華等對10個油棕品種RYL31～RYL40的8個月齡的袋育苗進行不同溫度梯度處理，采用主成分分析法進行抗寒性評價，認為丙二醛和相對電導率是評價油棕抗寒性的重要指標。曹紅星等根據MDA、Pro、SS等生理指標的變化的規律對哥斯達黎加引進的油棕資源TE、BE、OG和海南本地種BD的6個月齡的袋栽育苗進行抗寒評價，初步篩選出MDA丙二醛、Pro脯氨酸和谷胱甘肽還原酶（GR）酶3個抗寒指標。利用單一的指標很難客觀準確地反映植物的抗寒能力，目前隸屬函數法已廣泛應用于對不同資源或品種的抗寒性綜合評價，金龍飛等采用隸屬函數法對低溫脅迫下9個油棕品種的MDA、SP和SS等生理指標進行了抗寒性評價。林榕燕等采用隸屬函數法對6個秋石斛品種的SS、MDA和SP等生理指標進行抗寒性綜合評價，得出抗寒性評價結果與低溫半致死溫度（LT）和田間觀測結果基本一致。本研究選擇云南大理抗寒高產成齡油棕樹的自交F代，利用人工模擬低溫脅迫方法，通過觀察子一代群體在低溫脅迫后的寒害程度及其恢復生長情況將其劃分為4個寒害等級，并測定了4個寒害等級材料的MDA、Pro、SS含量以及POD和超SOD活性的變化，然后運用隸屬函數法對4個寒害等級材料的抗寒性進行綜合評價，以期為今后開展油棕抗寒性評價與利用提供參考。

? 材料與方法

材料

試驗材料為云南大理（100°72￠ E，25°50￠ N，海拔1381?m，年均溫14.9℃，極端最低溫?3.3～ 2.3℃）抗寒高產油棕成齡樹的自交F子一代有性系，總株數31株，苗齡為3年的盆栽苗，現存葉片總數為5～10片，株高100～150?cm。

? 方法

1.2.1? 低溫處理? 試驗于2021年2月在中國熱帶農業科學院橡膠研究所冷庫進行4℃低溫處理，設置4個時間梯度：0（對照）、1、3、5 d，每天光照12 h，脅迫后采集植株頂端下第2～3片葉葉軸中部兩側邊的小葉作為樣品，將葉樣用去離子水洗凈后再用錫箔紙嚴密包裹，然后放到液氮中速凍，最后轉移到–80℃超低溫冰箱保存待測。

1.2.2 ?寒害分級? 將所有植株低溫脅迫5?d后放置在自然條件下恢復生長1個月，然后每天對油棕葉片的寒害癥狀（葉片萎蔫、干枯以及槍葉干枯腐爛等）進行觀測，根據觀測結果劃分為4個寒害等級（表1）。

1.2.3? 生理指標的測定? 對油棕葉片的鮮樣進行生理指標測定，將同一寒害等級的油棕葉片樣品等量混合，每個寒害等級重復3次。可溶性糖（SS）含量和脯氨酸（Pro）含量采用南京建成試劑盒測定，丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化物酶（POD）活性采用索萊寶試劑盒測定。

1.2.4? 抗寒性評價? 參照付超等的方法，采用隸屬函數法對油棕進行抗寒性綜合評價，求出各寒害等級材料不同生理指標的隸屬函數值，公式如下：

式中：U表示寒害等級材料的生理指標的隸屬函數值，X表示寒害等級材料的 生理指標的測定值，表示所有寒害等級材料生理指標測定值的最小值，表示所有寒害等級材料生理指標測定值的最大值。與抗寒性呈正相關的生理指標采用公式（1）計算，與抗寒性呈負相關的生理指標采用公式（2）計算。

? 數據處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進行試驗原始數據整理，采用DPS軟件進行方差分析（Duncan’s多重比較法），采用Originpro 2018軟件進行繪圖。

?結果與分析

? 低溫脅迫對油棕葉片生長的影響

根據油棕幼苗低溫脅迫5?d后在自然環境下的葉片恢復生長情況劃分為4個寒害等級（圖1），其中1級、2級、3級和4級的植株分別為5株、14株、8株和4株，寒害率百分比分別為16.13%、45.16%、25.81%和12.90%（表2）。所有植株在低溫處理期間均無明顯的葉片寒害癥狀，但在恢復生長階段部分植株逐漸表現出寒害癥狀，其中恢復生長5?d后植株開始出現葉片形態變化，、槍葉基部變黑等癥狀;10?d以后槍葉變黑區域擴大，嫩葉心葉出現萎蔫，老葉葉緣干枯;20 d后槍葉干枯，小葉嫩葉褪綠變黃，出現褐斑，老葉干枯;30 d后嫩小葉褐斑增多，個別植株樹冠全部葉片干枯;除寒害4級的植株死亡外，其他等級的植株均能在2～4個月內恢復生長。由此可見，大多數油棕幼苗4℃低溫脅迫5?d后，能在2～4個月內恢復正常生長，說明云南大理抗寒成齡油棕樹的自交子一代具有較強的抗寒能力。

?低溫脅迫對油棕葉片丙二醛（）含量的影響

低溫脅迫下不同寒害等級油棕葉片MDA含量隨脅迫時間的延長均呈顯著上升的趨勢，以處理5?d時含量最高（圖2），且在不同時間處理間均達到極顯著差異（<0.01），說明隨著低溫脅迫時間的延長，油棕葉片細胞膜系統受害程度不斷加劇，但不同寒害等級材料的受害程度不同。在低溫脅迫下，不同寒害等級材料之間的MDA含量也存在顯著差異（P<0.05），寒害1級材料的MDA含量始終處于最低水平，其次是寒害2級材料，寒害4級材料除脅迫1?d外，其余均處于最高水平。不同寒害等級材料間的MDA含量增加

的幅度存在明顯差異，與對照相比，4級材料的MDA含量上升的幅度最明顯，上升198.2%，1級材料的上升幅度最小，上升137.2%，說明4級材料葉片細胞膜受損程度最高，抗寒能力最小，1級材料的葉片受損程度最小，抗寒能力最強。

?低溫脅迫對油棕葉片脯氨酸（Pro）含量的影響

如圖3所示，低溫脅迫下不同寒害等級材料間的Pro含量差異顯著（<0.05），隨脅迫時間的增加，4個寒害等級材料的Pro含量均有不同幅度的增加，且不同脅迫時間之間差異極顯著（<0.01），增加幅度最大為1級，最小為4級，

分別增加了100%和59.4%，說明不同等級材料通過提高增加自身Pro含量來增強提高其抗寒適應的能力存在差異。在低溫脅迫5?d后，1級材料的Pro含量最高，2級材料次之，3級和4級材料最小，說明1級材料抗寒性較強，3級和4級抗寒性較弱。

?低溫脅迫對油棕葉片可溶性糖（）含量的影響

低溫脅迫后不同寒害等級材料的SS含量較對照均有所升高（圖4），且不同脅迫時間之間差異極顯著（<0.01），隨低溫脅迫時間的增加，1級、2級和3級材料的SS含量呈上升趨勢，4級材料的SS含量呈先升高后下降的趨勢，在脅迫3?d時含量最高。低溫脅迫下不同寒害等級材料的SS含量增加的幅度不同，低溫脅迫5?d時，1級

材料的SS含量增加幅度最大，較對照增加49.0%，4級材料的增加幅度最小，增加10.1%。

? 低溫脅迫對油棕葉片過氧化物酶（）活性的影響

低溫脅迫下不同寒害等級材料的POD活性變化存在明顯差異，隨著低溫處理時間的增加，1級、2級和3級材料的POD活性均呈先上升后下降的趨勢，而4級材料呈先上升再下降又上升的趨勢（圖5）。低溫處理1?d后，4個等級材料的POD活性均達到最高，分別較對照增加38.5%、11.8%、32.8%、57.5%，且極顯著高于其他處理（<0.01）;低溫處理5?d時，1級、2級和3級材料的POD活性均低于對照，分別較對照降低6.1%、31.1%、48.0%，僅4級材料的POD活性

高于對照，較對照增加34.2%，且極顯著高于其他材料（<0.01）。

?低溫脅迫對油棕葉片超氧化物歧化酶（）活性的影響

如圖6所示，隨著低溫脅迫時間的增加，4個等級材料的SOD活性均呈不同幅度的增加趨勢，且不同脅迫時間之間差異極顯著（<0.01），寒害1級材料的SOD活性均處于最高值，寒害4級材料均處于最小值。不同寒害等級材料的變化幅度明顯不同，寒害1級材料SOD活性的增加幅度最大，2級和3級次之，4級的增加幅度最小，分別較對照增加653.8%，355.7%、337.1%和279.3%，脅迫0～3?d時，4個材料的SOD活性增加幅度更加明顯，脅迫3～5?d時，2級、3級和4級增加幅度較為緩慢，而1級材料增幅較快，說明不同寒害等級材料對低溫抵抗能力存在差異。

?隸屬函數綜合分析

采用隸屬函數法，對低溫脅迫下4個寒害等級材料的MDA含量、Pro含量、SS含量、SOD活性和POD活性等5項指標的隸屬函數值求得平均值，平均隸屬函數值越大說明抗寒能力越強，反之抗寒能力越弱，其中Pro、SS、SOD和POD與油棕抗寒性呈正相關采用隸屬函數公式計算，MDA與油棕抗寒性呈負相關則采用反隸屬函數公式計算。各寒害等級材料的平均隸屬函數值如表3，由表3可見，4個材料的隸屬函數值差異較大，介于0.040～0.847之間，按照排名得到4個材料的抗寒性綜合評價結果，表明4個材料的抗寒能力

表現為1級>2級>3級>4級，表明隸屬函數綜合評價結果與低溫脅迫后的植株寒害分級結果一致，說明隸屬函數法也可以作為油棕抗寒性評價的方法。

討論

低溫是植物生長過程中重要的非生物脅迫因子，植物受到低溫脅迫時，會發生一系列的生理響應變化，以抵御不良環境，評價植物抗寒生理特性，可在一定程度上反映植株對低溫的耐受程度。MDA是植物葉片膜脂過氧化作用的重要產物，隨著低溫脅迫程度的加劇，植物體內的MDA含量升高，葉片細胞膜系統受損愈加嚴重，被認為是反映植物抗寒性的重要指標。本研究表明，在低溫脅迫下，隨著脅迫時間的增加，4個不同寒害等級油棕的葉片MDA含量總體呈不同幅度升高趨勢，這與曹紅星等 、楊華庚等和劉艷菊等的研究結果一致，但不同寒害等級油棕的MDA含量在不同脅迫時間下差異明顯，抗寒性弱的材料增加幅度大，抗寒性強的材料增加幅度小，且抗寒性弱的材料MDA含量極顯著高于抗寒性強的材料，寒害程度最低的1級材料的MDA含量在低溫脅迫下明顯低于其他材料，說明其受低溫的影響較小。

Pro、SS等滲透調節物質是評價植物抗寒性的重要指標，研究發現，低溫脅迫下，植物通過提高Pro和SS等滲透調節物質含量來維持細胞滲透平衡，進而減輕低溫對植物機體的傷害。本研究結果發現，低溫脅迫下，不同寒害等級材料的Pro和SS含量隨脅迫時間的增加呈升高的趨勢，但不同寒害等級材料的增加幅度不同，隨著脅迫程度的加劇，抗寒性強的材料能積累更多的Pro和SS，這與曹紅星等和劉艷菊等的研究結果類似，隨脅迫時間的增加，寒害1級、2級和3級材料的SS含量升高，而4級材料的SS含量呈先升高后降低的趨勢，可能是脅迫時間超過一定值時植物體內的可溶性糖合成受抑制，說明該材料對低溫脅迫的防御機能減弱。

POD和SOD是植物體內重要的抗氧化酶，當植物處于低溫環境下，體內會不斷產生活性氧自由基，植物可通過抗氧化酶系統消除活性氧自由基，從而減輕低溫造成的傷害。本研究發現，低溫脅迫下，隨著脅迫時間的增加，各寒害等級材料的SOD活性呈升高的趨勢，這與LI等的研究結果一致，不同材料SOD活性的變化存在明顯差異，抗寒性強的材料升高的速率較快，抗寒性弱的材料升高的速率較慢，寒害1級材料始終處于最大值，4級材料始終處于最小值，說明1級材料抗寒能力最強，4級最小;POD活性隨脅迫時間的延長呈先升高再降低的趨勢，脅迫1?d時達到最大值，除4級材料外，其余材料均在5?d時達到最小值，且顯著低于對照。

低溫脅迫下，形態觀測法是鑒定植物抗寒性最直觀接、簡單的方法，低溫脅迫對油棕形態有很大影響，直接表現為生長延緩、葉片萎蔫、黃化、干枯、出現褐斑、產量下降、凍死等形態變化。本研究結果發現，低溫脅迫期間所有油棕葉片表現正常，無任何寒害癥狀，脅迫解除后，恢復生長階段逐漸出現寒害癥狀，隨著新葉的長出，大部分植株能在2～4個月內恢復優美的外觀，少數植株無法恢復生長而死亡;癥狀較輕時槍葉基部受害，葉片褪綠變黃，稍微嚴重時葉片干枯，出現褐斑，整個槍葉干枯，嚴重時整株干枯死亡，與前人研究結果類似。

影響植物抗寒性狀的因素十分復雜，單一的指標很難準確全面地反映植物的抗寒性實質，應結合生理生化、形態變化以及基因調控等表型、基因型性狀進行抗寒性評價。本研究對云南大理抗寒油棕成齡樹的31株自交子一代幼苗進行4℃低溫脅迫0、1、3、5?d，根據葉片寒害程度及其恢復生長情況可劃分出4個寒害等級材料，研究發現低溫脅迫后，寒害較輕的油棕的葉片MDA含量和SOD活性均分別低于和高于寒害較重的高材料，可作為油棕抗寒性鑒定的參考指標，。此外，低溫脅迫后油棕葉片的生理指標的隸屬函數值的大小與寒害等級劃分結果一致，表明隸屬函數法在油棕抗寒性評價中具有一定的準確性和可行性，但本研究只采用抗寒高產油棕成齡樹油棕品種為材料，所得結果是否適用于其他油棕材料品種資源還有待進一步確認。

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9. 收稿日期 2021-07-29;修回日期 2021-09-23

   基金項目 農業農村部品種改良提升專項“油棕種質資源精準評價和新品種培育”（No. NYPZ2020108）;中國熱帶農業科學院

   基本科研業務費專項資金（No. 1630022020011）;海南省自然科學基金項目（No. 320QN352）。

   作者簡介 程秋如（1996—），女，碩士研究生，研究方向：油棕種質資源評價。*通信作者：劉子凡（LIU Zifan），E-mail：

   jiangxilaobiao@163.com;曾憲海（ZENG Xianhai），E-mail： zxh200888@126.com。