不同生長(zhǎng)期粉葛不同部位中黃酮類成分動(dòng)態(tài)積累分析與評(píng)價(jià)

★ 曾慧婷 張媛媛 陳超 黃琦 何小群 張建華 王小青 李晶 虞金寶（. 江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046；. 江西綠色生態(tài)葛研究所 江西 上饒 334000）

粉葛為豆科植物甘葛藤（Pueraria thomsoniiBenth.）的干燥根，與臨床常用藥材葛根（Pueraria lobate＜Willd.＞ Ohwi），均具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等功效［1］，富含系列黃酮類化合物，如葛根素、大豆苷、染料木苷、染料木素、大豆苷元等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，該黃酮類成分在心血管系統(tǒng)、降血糖、抗癌、抗酒精中毒、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞等方面表現(xiàn)出顯著藥理活性［2-6］。粉葛作為提取食用葛粉的主要來源，其淀粉含量高達(dá)40%，故素有“北參南葛”“亞洲人參”之稱。葛根（野葛）多為野生，分布極廣，除新疆、西藏和青海等少數(shù)省份外，全國(guó)各省區(qū)均有分布，粉葛則多為栽培種，在廣東、廣西、江西、云南、四川、重慶等地均有人工栽培［7］。關(guān)于葛的產(chǎn)區(qū)為歷代本草所記載，《本草經(jīng)集注》曰：“南康、廬陵間最勝，多肉而少筋，甘美；但為藥用之，不及此間耳”，《圖經(jīng)本草》曰：“今處處有之，江浙尤多”，均指出江西已是葛根的主產(chǎn)區(qū)之一，且葛根味道甜，適合食用［8］。

隨著粉葛在醫(yī)藥及食品領(lǐng)域需求量的不斷增加，加之國(guó)家中藥大健康產(chǎn)業(yè)相關(guān)政策的引導(dǎo)，粉葛種植得到大面積推廣。除用于提取淀粉、制作葛粉系列保健食品，目前對(duì)于粉葛的研究尚主要集中于其根部，葛根采收加工時(shí)其地上部分莖葉、蘆頭、葛根渣等廢棄物往往未得到有效利用，為環(huán)境帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，文獻(xiàn)報(bào)道及前期研究發(fā)現(xiàn)，該類廢棄物中尚含有豐富的黃酮類、多糖類、蛋白質(zhì)類等資源性化學(xué)成分［9-10］。本文以江西省粉葛新培育品種“贛葛2號(hào)”為研究對(duì)象，對(duì)不同生長(zhǎng)期粉葛根、莖和葉中4種主要黃酮類成分（葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元）進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，以期為粉葛地上部分莖和葉的采收和資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

HP-1260全自動(dòng)高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；CQ-250超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所）；AG-135電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速中藥粉碎機(jī)YF-1000（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 材料

葛根素（批號(hào)：1110752-201615）、大豆苷元（批號(hào)：111502-200402）、大豆苷（批號(hào)：111738-201603）等對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，染料木苷（批號(hào)：B21038）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

粉葛樣品于2018年5月—2018年12月采自江西綠色生態(tài)葛研究所“贛葛2號(hào)”種植基地，經(jīng)江西省中醫(yī)藥研究院虞金寶研究員鑒定為粉葛（P. thomsoniiBenth.）的栽培品種（一年生），樣品（根、莖和葉）采集后于50℃烘干，經(jīng)粉碎成粗粉（40目），常溫密封干燥保存，供分析用。取樣時(shí)間、生長(zhǎng)階段、物候期及對(duì)應(yīng)的采收部位劃分見表1。

表1 取樣時(shí)間、生長(zhǎng)時(shí)期及采收部位

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動(dòng)相為0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，85% A；2～10 min，85%～80% A；10～14 min，80%～70% A；14～20 min，70%～68% A；20～28 min，68%～40% A；28～30 min，40%～85% A；30～31 min，85% A。柱溫35 ℃恒溫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元對(duì)照品適量，用80%甲醇配成質(zhì)量濃度分別為0.294、0.162、0.183、0.260 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密取不同生長(zhǎng)期粉葛根、莖和葉樣品粉末1.00 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 60%乙醇，稱重，90 ℃回流1 h，補(bǔ)足失重，趁熱濾過，合并濾液，0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察取混合對(duì)照品貯備液，分別稀釋成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下分別進(jìn)樣，記錄峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4個(gè)黃酮類成分的回歸方程及線性范圍，檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）分別在信號(hào)對(duì)噪音比值為3和10時(shí)測(cè)定。所測(cè)定的4個(gè)化學(xué)成分線性關(guān)系良好，且靈敏可靠。見表2。

表2 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.4.2 精密度試驗(yàn)取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，得到葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元峰面積的RSD分別為0.24%、0.14%、0.09%、0.11%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取8月份采葛莖1號(hào)樣品的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，得到葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元峰面積的RSD分別為2.13%、3.70%、1.62%、2.45%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)取8月份采葛莖1號(hào)樣品6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各峰面積，葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元峰面積的RSD分別為2.31%、1.28%、2.01%、1.92%。表明重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取6份已知含量的8月份采葛莖1號(hào)樣品粉末各1 g，分別加入適量對(duì)照品混合液，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，依次測(cè)定，計(jì)算各對(duì)照品的平均回收率，得到葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元的平均回收率分別為101.10%、99.25%、98.64%、100.89%，測(cè)定其RSD分別為1.39%、2.51%、1.96%、2.03%。

2.5 樣品測(cè)定

所有樣品按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算各化合物含量，混合對(duì)照品及粉葛不同部位樣品HPLC色譜圖如圖1所示，不同采收期粉葛不同部位中黃酮類成分含量動(dòng)態(tài)積累變化見表3、圖2。

圖1 混合對(duì)照品及粉葛不同部位樣品HPLC色譜圖

結(jié)果顯示，粉葛的根與莖中黃酮類成分相似，主要為葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元，葛葉中除葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元外，尚有含量較高的成分待鑒定。以所測(cè)定的葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元的含量之和計(jì)算總黃酮含量，總黃酮含量在粉葛不同部位中的分布為根＞莖＞葉。

3 討論

3.1 粉葛不同部位中黃酮類化學(xué)成分的分布特征

表3結(jié)果顯示，通過HPLC法檢測(cè)粉葛中4種黃酮類成分（葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元）含量，發(fā)現(xiàn)葛根素在根中含量最高，可達(dá)3.06%，其次為莖，最高可達(dá)0.78%，在葉中含量最低。大豆苷在粉葛不同部位中的分布規(guī)律同葛根素，為根＞莖＞葉，染料木苷的含量分布特征為莖＞葉＞根，大豆苷元在根中的含量高于莖，在葉中未檢測(cè)到，表明粉葛地上部分與地下部分中皆含有黃酮類成分。根據(jù)HPLC色譜圖（圖1）可知，粉葛根與葛藤莖中化學(xué)成分組成相似，葛葉中除含有與根、莖相同的黃酮類成分，尚有多種含量可觀的成分有待確定，且筆者前期研究發(fā)現(xiàn)葛花中黃酮類成分完全不同于粉葛根、莖、葉，主要為鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷、染料木苷、鳶尾苷、葛花苷、6″-O-木糖基黃豆黃苷，在葛根果實(shí)中未檢測(cè)到相關(guān)化學(xué)成分，這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［9，11］。

表3 不同采收期粉葛不同部位中黃酮類成分含量測(cè)定 mg/g

3.2 不同生長(zhǎng)期粉葛不同部位中黃酮類成分動(dòng)態(tài)積累規(guī)律

植物體是一個(gè)整體，各組織、器官和系統(tǒng)間存在一定生長(zhǎng)相關(guān)性，彼此獨(dú)立分工又緊密聯(lián)系，植物環(huán)境因子如水分、溫度、光照等對(duì)植物生長(zhǎng)和有效成分積累存在巨大影響。不同生長(zhǎng)期粉葛根、莖和葉中黃酮類成分含量動(dòng)態(tài)積累變化如圖2所示，在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，粉葛根中黃酮類成分含量隨時(shí)間呈逐漸遞增趨勢(shì)，在10月底地上部分枯萎，進(jìn)入根部速生期時(shí)達(dá)到最高，之后稍有所回落，最高為3.51%。葛莖中有效成分的積累分別在7月快速生長(zhǎng)期和12月休眠期達(dá)到峰值，可達(dá)1.31%。葛葉中黃酮類成分積累在10月底地上部分枯萎時(shí)達(dá)到最高。考慮粉葛為多年生植物，黃酮類成分含量可能因生長(zhǎng)年限增加而積累?？傮w來看，粉葛根中有效成分黃酮類含量在秋、冬季為最高，同《中國(guó)藥典》所記載“秋、冬二季采挖”一致。莖是根和葉之間起輸導(dǎo)和支持作用的植物體重要營(yíng)養(yǎng)器官，葛莖中有效成分含量在7月和12月最高，而葉中黃酮類成分在10月積累量最大，綜上所述得出，粉葛地上部分資源性化學(xué)成分種類豐富且含量可觀，可作為獲取黃酮類資源性化學(xué)成分的新來源加以利用，在秋冬季粉葛采收時(shí)，即其地上部分莖葉的適宜采收期。

圖2 不同生長(zhǎng)期粉葛不同部位中黃酮類成分含量動(dòng)態(tài)積累變化

3.3 粉葛地上部位資源性價(jià)值分析與資源利用探討

葛根和粉葛均被歷版藥典所收載，且同為藥食同源品種，葛根（野葛）為臨床常用中藥材，主要活性成分為黃酮類化合物，其傳統(tǒng)用藥部位為地下根，粉葛功能主治同葛根，作為提取葛粉的主要來源。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為粉葛培育品種“贛葛2號(hào)”，通過研究粉葛不同部位不同生長(zhǎng)期黃酮類成分分布及動(dòng)態(tài)積累規(guī)律，揭示粉葛地上部分中富含黃酮類成分，尤其是葛莖含有同根部相同的化學(xué)成分，葛根素含量可達(dá)2.86%，超過藥典規(guī)定葛根（野葛）中葛根素≥2.40%的含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，葛莖、葉中黃酮類成分經(jīng)提取富集可用于制備天然抗氧化劑、治療或改善心血管疾病的醫(yī)藥中間體和醫(yī)藥保健產(chǎn)品。此外，葛莖和葉中富含蛋白質(zhì)、多糖、微量元素等資源性化學(xué)成分，具有廣泛應(yīng)用前景，可用于保健食品、膳食補(bǔ)充劑和動(dòng)物青貯飼料的開發(fā)［12］。

眾所周知，在中藥材種植生產(chǎn)過程中，適宜采收期對(duì)于藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量至關(guān)重要。本研究通過采收不同生長(zhǎng)期粉葛不同部位，對(duì)其黃酮類成分進(jìn)行定性定量分析，在明確粉葛根、莖和葉中主要化學(xué)成分的同時(shí)，對(duì)其生長(zhǎng)過程中黃酮類成分的動(dòng)態(tài)積累進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)，若以黃酮類成分積累量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在秋冬季粉葛采挖時(shí)其地上莖葉可采收加以利用，若以粉葛地上部分莖葉中蛋白質(zhì)、多糖等初生代謝產(chǎn)物為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其最佳采收期的確定還需進(jìn)一步研究。本文基于前期研究，為粉葛莖、葉資源價(jià)值的發(fā)現(xiàn)及其綜合利用提供科學(xué)依據(jù)，要全面認(rèn)識(shí)粉葛莖、葉，以達(dá)到資源的最大化利用，還需大量深入細(xì)致的系統(tǒng)性研究。