農藥殘留檢測關鍵用酶固定化研究進展

朱永安 王淼 曹靜 喻鶴 曹振 金茂俊 王靜 佘永新

（中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所 農業農村部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081）

在農藥的使用保障了我國糧食穩定生產的同時，不合理和過量的施用也引起了農藥殘留超標的問題，殘留的農藥及其代謝物可以通過富集作用在食物鏈中不斷傳遞、遷移，從而對農產品質量安全、生態環境造成不良的影響，進而危害人類健康［1］。

為了對農產品中農藥殘留進行檢測，常規的儀器檢測方法往往檢測時間較長，且成本較高，并不適用于實際生產經營過程中農產品的快速檢測。酶抑制法作為一類快速篩查方法，可以對農藥殘留進行快速檢測，其中最關鍵的步驟是農藥殘留對酶的抑制效果的分析，但是游離酶由于穩定性差且在有機溶劑環境下不耐受，而固定化酶可以改善游離酶的缺陷，將酶固定于載體上，同時保留一定的催化活性。本文重點論述了固定化技術、載體及產品在農藥殘留檢測中的應用，為今后農藥殘留檢測固定化酶研究提供一定思路和方法。

1 酶的固定化技術分類

1.1 吸附法

吸附法是利用物理方法，將酶固定于載體上，可分為離子吸附、親和吸附及物理吸附。物理吸附是最常用的，通過氫鍵、范德華力、疏水相互作用將酶吸附在載體的表面［2］。例如Tallita等［3］將堿性磷酸酶（ALP）以物理吸附的方式固定在聚合物改性電極上制成的電化學傳感器可以用于檢測4-硝基酚（4-NP）。

1.2 包埋法

包埋法是將酶固定在聚合物材料的網格結構或微囊結構等多空隙載體中。用于包埋的載體一般是殼聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂、海藻酸鈣等。該方法可以降低酶的滲出，同時酶與載體之間無化學鍵連接，保持了酶構象的穩定。然而，底物與酶反應時，會因為包埋結構的特殊性導致底物無法通過保護層而與酶進行反應，這是目前包埋法固定酶的主要缺點之一。同時，僅以物理方法包覆酶可能導致酶的負載效率低［4］。

應用較為廣泛的包埋法是溶膠-凝膠法，Du等［5］用正硅酸乙酯和納米金顆粒（GNPs）制成了用于包埋酶的溶膠-凝膠復合材料，將乙酰膽堿酯酶（AChE）包埋其中制成生物傳感器，對有機磷農藥進行檢測。在抑制率10%時久效磷的檢出限為0.6 ng/mL，且具有良好的重現性和穩定性。

但由于溶膠-凝膠法包埋過程中酶容易失活［6］，因此一些新的包埋技術也被逐漸研究，江南大學孔軍等［7］在研究酶的固定化時發明了一種新的包埋技術，以缺陷型釀酒酵母孢子微膠囊將酶固定化。該方法利用基因工程技術將酶以包埋法形式固定，對比溶膠-凝膠法，可以減少因包埋過程中引入有機溶劑對酶活性造成的損失。

1.3 共價結合法

由于酶的表面存在很多游離基團，如羧基、氨基、巰基等可以與載體表面基團發生化學反應生成共價鍵，以此原理固定化酶的方法為共價結合法。AChE上含有氨基，因此Khaldi等［8］將單晶硅表面羧基化后，通過酰胺鍵將AChE共價連接至羧基端。Tallita等［3］同樣將電極上的羧基活化后，與堿性磷酸酶（ALP）以形成酰胺鍵的方式進行固定化，制成的電化學傳感器可對有機磷農藥進行靈敏檢測。

另外還有研究者利用酶表面的羧基進行固定化，Jiang等［9］將膠體金納米顆粒和重氮樹脂固定于對氨基苯磺酸修飾后的玻碳電極表面，形成基質復合膜，用于乙酰膽堿酯酶的固定。類似的基于形成化學共價鍵的方式固定化可以使酶與載體結合緊密，不易從載體表面脫落。但是由于酶與載體以共價鍵結合后可能會導致酶的空間構象發生變化，對酶活會造成不同程度的損失。因此以共價結合法固定酶時應該考慮到該缺陷。

1.4 交聯法

交聯法是利用交聯劑與酶蛋白進行交聯，通過形成穩定的三維交聯網架結構將酶固定。如果交聯的是相同的官能團，則被稱為同雙功能交聯劑，例如戊二醛。若交聯劑連接的是不同的基團則該種交聯劑被稱為異雙功能試劑［10］。

交聯法固定化酶中，戊二醛試劑［11］被廣泛使用。毛罕平等［12］使用戊二醛將AChE交聯在紙制微流控系統中用于檢測對硫磷，檢測線性范圍在1.0×10-7-1.0×10-5g/mL內，檢出限為3.3×10-8g/mL。與其它固定化酶方法相比，戊二醛在交聯酶時用量較大，當用量大于一定閾值后會使酶失活。Sun等［13］用戊二醛作為交聯劑，采用交聯法和溶膠-凝膠包埋法兩種不同的固定化方法將AChE固定在殼聚糖膜上，結果表明用戊二醛作為交聯劑固定化酶的活性明顯低于溶膠-凝膠包埋法。所以采用交聯法固定化酶時需要優先考慮交聯劑的類型是否會對酶造成毒害作用。

1.5 氨基酸置換法

利用對蛋白質進行定點誘變的基因工程技術可以直接改變酶的性質，這種蛋白質性質的變化還可以用于酶的固定化，提高酶的催化性能［14］。即在酶蛋白上合適位點，置換某個氨基酸，突變后的酶蛋白通過該突變氨基酸特殊的側鏈基團控制固定酶的方向。Li等［4］通過迭代飽和誘變（ISM）方法篩選得到催化活性最高的甲基對硫磷水解酶（MPH）突變產物，實驗證明突變酶可以對甲基對硫磷進行高效地水解，以誘變方法得到突變酶的思路可以借鑒到對農藥殘留檢測當中。但關于這方面的報道還較少，需要進一步研究其實用性。

1.6 生物素-親和素親和法

生物素-親和素親和法基于生物素與親和素高效專一性、極強的親和力可以把酶蛋白與生物素結合成融合蛋白以后，再將融合蛋白固定在親和素包被的材料中。Zhang等［15］制備了一種基于生物素-鏈霉親和素耦聯合成方法的免疫傳感器用于檢測細胞因子IL-6的濃度變化，與共價結合方法相比，該方法可以增加固定在載體表面的抗體數量，使免疫傳感器的檢測靈敏度達到0.1 pg/mL，檢測的線性范圍在0.4-400 pg/mL間。

2 酶的固定化載體

2.1 無機載體

無機載體主要是指利用二氧化硅、黏土材料等作為基質復合形成的固定化材料，這類材料具有孔隙率大、無毒、綠色等特點，但缺點在于作為單一基質其穩定性不高，需要和有機材料復合形成更穩定的載體。

2.1.1 二氧化硅 由于硅材料具有良好的生物相容性，毒性小，化學性質較為穩定，被廣泛用于酶的催化和制造傳感器。Yang等［16］采用SiO2作為納米片（SNS）再結合全氟磺酸（NF）用于修飾玻碳電極（GCE），通過殼聚糖固定AChE，制成了檢測有機磷農藥的生物傳感器，對甲基對硫磷、毒死蜱、克百威具有很低的檢出限。然而，以二氧化硅作為載體的固定材料缺點在于在固定過程中酶的定向性較差，在包覆酶的過程中還容易使酶發生變性進而影響傳感器的性能［17］。

2.1.2 黏土材料 黏土材料基于其結構和功能特性，可以作為吸附劑用于生物催化過程中。在酶的固定化中常用到的生物納米復合材料可以由不同的黏土礦物和生物高分子組裝形成。研究發現第一種有機-無機混合納米結構材料便是基于天然硅酸鹽合成的，即黏土材料［18］。黏土材料的特定晶體結構與傳統的混合材料相比具有一定優勢。

2.2 有機高分子載體

有機高分子載體主要分為天然高分子載體和合成高分子載體。天然高分子載體例如殼聚糖、纖維素等具有無毒環保、良好的生物相容性等優點。合成高分子載體則以樹脂材料和聚酯型復合材料居多，其優點是機械強度高且物理化學性質穩定［19］。但是合成高分子材料對生物相容性較差，且具有一定的細胞毒性。

2.2.1 天然高分子載體

2.2.1.1 殼聚糖 殼聚糖是一種具有生物相容性、無毒的固定化酶的基質，可以對其進行化學改性，并且殼聚糖易于修飾。將其用作固定化載體，可穩定AChE活性。Patel等［20］將殼聚糖固定的AChE用于食品中殘留的有機磷農藥檢測，在反應前后酶活仍舊維持穩定。此外，殼聚糖通常也與其他固定材料復合以改善殼聚糖對反應環境耐受性較差的缺點。例如Bayramo?lua［21］提出了使用甲基丙烯酸殼聚糖復合材料作為固定化酶的載體，增強了酶的反應環境耐受性，與游離酶（50℃）相比，固定化酶反應溫度可以提高至62℃，同時游離酶在反應15 d內全部失活，而采用甲基丙烯酸殼聚糖復合載體的固定化酶在循環使用8次后仍然保留了40%以上的相對活性，可見殼聚糖復合型材料作為固定化酶的基質具有穩定酶反應條件的特點。

2.2.1.2 纖維素 纖維素和殼聚糖同屬于多糖類，也具有良好的生物相容性、無毒等特點。伍周玲等［22］采用微晶纖維素為原料制備了雙醛纖維素，該材料用作生物傳感器中AChE的固定，對敵敵畏的檢出限為6.99 ng/mL。以纖維素作為固定化載體成本較低且固定化酶的性質較為穩定，可以提高對酶的負載量，間接提高酶與底物的反應速率［23］。

2.2.2 合成高分子載體

2.2.2.1 樹脂材料 溶膠-凝膠法在酶的固定化中應用較為廣泛，而樹脂材料是溶膠-凝膠合成固定化酶的常用載體。有報道使用了低聚硅氧烷樹脂材料結合非水解溶膠-凝膠法將AChE共價固定化，該樹脂材料可以使AChE的固定化率達到80%以上，且在一定的pH（5.5、5.8）和相對較高的溫度（40℃以上）中，樹脂材料固定的AChE活性高于游離酶，固定化酶還增強了的貯存穩定性以及對某些金屬陽離子的抑制作用［24］。Li等［25］通過戊二醛將酶固定在NKA-9樹脂上，在NKA-9樹脂上的負載量為34.4 mg/100 mg，因此樹脂材料還可提高酶的負載量。

2.2.2.2 聚酯材料 聚酯材料是用化學方法將有機二元酸和二元醇縮聚合成的纖維，屬于高分子化合物。聚酯材料制備的固定化酶載體，由于其化學性能穩定且具有一定的強度，可以使酶的穩定性增強。Gao等［26］通過共價結合的方法將有機磷降解酶A（OpdA）固定在高孔洞的非織造聚酯織物：聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）表面，用于對有機磷農藥的降解。固定化酶在酸性環境中仍保持較高的活性，在4℃磷酸鹽緩沖液中還可保存至少4周以上。Han等［27］將一種由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的單體材料作為固定化辣根過氧化物酶（HRP）的載體。固定化酶在60℃時表現出較強的穩定性，在循環使用6次后，HRP仍然可以保持52%的原活性。雖然聚酯材料的優良物理化學特性可以為酶的催化反應和保存提供穩定的環境，但還要考慮酶在聚酯材料上的兼容性，且目前國內外將酶固定在聚酯材料上進行農藥殘留檢測的相關研究報道較少，須進一步考究其適用性。

2.3 磁性材料

磁性材料作為固定化酶的基質具有更好的穩定酶活的作用，如目前應用較為廣泛的基于生物炭或二氧化硅基質包覆的磁性材料，具有低毒、易于回收、清潔高效等特點。在適宜條件下利用二氧化硅包覆的磁性納米材料在滿足核殼均一的前提下，還應盡可能提高納米顆粒的比表面積，同時制備的磁性材料可以對不同基質進行修飾。Won等［17］報道了一類由Fe3O4磁性無機核、介孔二氧化硅和AChE制成的磁性生物復合材料。該磁性材料用于修飾SPE電極，將對氧磷的檢測轉化為電信號。用磁性材料制成的傳感器具有良好的操作穩定性、重現性和酶活性，對氧磷的檢測限在納摩爾范圍。

此外Li等［28］通過Fe3O4@SiO2復合材料包覆AgNPs，成功合成了Fe3O4@SiO2@Ag，該材料具有較大的表面拉曼增強效應（SERS），對福美雙的拉曼信號進行檢測，其檢測限為0.24 ppm。像這樣含有兩種或者兩種以上不同材料包覆的磁性載體具有多種性能，可以對檢測信號起到放大作用，將金屬納米粒子包覆在磁性載體上還展現出一定的SERS性能，對于解決檢測靈敏度低的問題，提供了良好的借鑒方法。

2.4 介孔材料

介孔材料是一種孔徑在2-50 nm的多孔材料，因為其孔徑分布較窄，比表面積極高，同時該類材料的間隙結構分布優越，被逐漸用于對各種蛋白質和酶的固定化［29］。最早發現的介孔材料是由氧化硅組成的孔狀三維結構物質。之后的研究中也出現了許多非硅系介孔材料。硅系介孔材料如Ji等［30］利用介孔二氧化硅（MSN）為載體制備了酶-抗體結合型免疫傳感器，利用硅烷化試劑（GPTMS）將MSN表面功能化后用酶和第二抗體（Ab2）對其進行標記（制備過程見圖1），檢測時再將信號放大成比色信號。

圖1 基于MSN載體免疫傳感器制備流程Fig. 1 Preparation process of MSN carrier immunosensor

非硅系載體則主要包括磷酸鹽、金屬氧化物和介孔碳等，與介孔二氧化硅類似，具有高比表面積和納米孔道結構。Wu等［31］利用非硅系介孔材料——介孔碳（BCs）制備了電化學發光（ECL）傳感器用于檢測農藥阿特拉津（ATZ），對阿特拉津的檢出限為0.08 ng/L。

介孔材料雖然都具有高比表面積的特性，可以將固定化酶的負載量提高，但是不同的介孔材料由于其表面化學性質不同，因此對酶固定化過程的影響也大相徑庭。而MSN作為固定化酶的載體具有效益高的優點，表面功能化的MSN是介孔材料的首選。

2.5 納米材料

納米材料是一類尺寸介于1-100 nm的材料，具有優越的導電性、良好的催化活性及無毒清潔等特點被用于制備生物傳感器的重要材料［32］。Quan等［33］采用酶法合成、自由基聚合以及靜電紡絲相結合的方法制備了含多碳納米管（MWCNTs）的丙烯腈共聚物納米纖維，將多碳納米管加入后可以增強載體的多孔性，為酶的固定提供了更多結合位點。

納米材料制備的固定化酶載體除了可以增加材料的比表面積外，將納米材料表面功能化后還可以控制蛋白質的吸附和定向，增強酶與載體之間的親和力［34-35］。Yu等［34］通過制備氨基化的多碳納米管CNT-NH2和羥基化的多碳納米管CNT-OH，將AChE固定在不同的納米管上。結果顯示更多的AChE吸附在CNT-NH2上，且兩種不同帶電性的材料都比原始碳納米管固定的AChE更多。還有研究人員對其他納米材料進行表面功能化，Mahmoudifard等［36］制備了一種基于表面化學修飾的聚醚砜（PES）納米纖維膜，用EDC/NHS耦聯策略將抗體固定在該納米纖維膜上。另外無機材料同樣可以作為固定化酶的載體，如Mei等［37］用硅酸鹽（CuSiO3）制備的載體對酶的負載量為140 mg/g。因此納米材料由于具有優良的物理性能（高比表面積）及表面功能化后的化學性能（親和性），使其成為了固定化酶載體的又一選擇。

2.6 金屬有機框架（MOFs）

金屬有機框架（MOFs）作為固定化酶的材料，具有提高酶穩定性和活性，可調節孔徑大小以及選擇性等特點。以MOFs材料為載體可以通過物理吸附、共價結合、分子自組裝等方式將酶固定在其多孔結構中從而賦予了MOFs材料催化性能。合成后的MOFs材料具有選擇性和催化活性高的特點［38］。這種基于晶體納米材料的結構，只需利用特定的固定方法將酶引入MOFs結構中即可［39］。同時，由于金屬和配體形成的結構具有拓撲學性質，可以根據需要對載體材料進行設計［40］。因而MOFs作為固定化酶的載體具有很好的前景。

Cai等［41］提出了基于金屬有機框架和大孔樹脂將酶固定化的一種方法，將酶封裝到沸石咪唑骨架-8（ZIF-8）中，然后通過物理吸附進一步與大孔樹脂D101結合形成金屬有機框架復合材料CAL-BZIF-8@D101，經過10次循環使用后相對酶活仍保留了84.20%。

但以MOFs材料作為固定化酶的載體還存在不足之處，在固定化時酶容易滲漏，且底物與酶的作用不緊密，在MOFs材料中酶和底物的接觸因為框架結構的大小而被限制。而利用微流控技術合成的缺陷型MOFs，可以使底物與酶的接觸面積增大，從而提高了酶的活性［42］，其原理如圖2所示。

圖2 缺陷型MOFs合成過程Fig. 2 Synthesis process of defective MOFs

除了使用缺陷型MOFs材料以外，南開大學陳瑤研究員團隊對MOFs材料固定化酶則采取了一種新的思路來解決因為MOFs材料狹窄孔道造成的酶催化效率低的問題。該方法將酶用一鍋法固定于MOFs材料中后再包覆COFs外殼，最后在溫和的條件下將MOFs降解［43］，依靠COFs寬闊的孔徑使底物與酶充分接觸，該方法見圖3。

圖3 三步法制備COF膠囊結構Fig. 3 Preparation of COF capsule structure by three-step method

MOFs載體具有較大比表面積和孔隙率可以為酶的固定提供更多結合位點，含有的金屬離子還可以提高電子轉移性能而增強檢測時的電信號，其在農藥殘留檢測中的案例見表1所示。

表1 不同類型MOFs載體檢測性能比較Table 1 Comparison of detection performance of different types of MOFs carriers

3 固定化酶產品在農藥殘留檢測中應用

固定化酶技術的實際應用除了常見的試紙條和速測卡，還有微流控系統和生物傳感器等，由這幾類檢測技術開發的產品在快速農藥殘留檢測中發揮了重要作用，是農產品農藥殘留篩查、監管和防控的科學工具，為消費者食用安全提供了一定保障。

3.1 試紙條

農藥殘留檢測試紙條是常見的一種快速檢測產品。試紙條制備的常見方法是將酶固定在載體膜片上，然后固定于底板中。將樣品滴在膜片上后加入底物進行顯色，由于存在一定的農藥殘留會使酶活受到抑制，底物不能完全水解，因而顯色程度淺。根據此原理，廣州綠洲生化科技有限公司基于國標方法［53］生產的天福牌農藥速測卡可以在15 min內對果蔬中有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥殘留進行快速檢測，對呋喃丹、敵敵畏等農藥的最低檢出限小于0.5 mg/kg。

3.2 微流控系統

由微型制造分析設備與集成組件構成的全微型分析系統又稱為微流控系統。微流控系統由于可移植性，樣本、試劑消耗低，廢棄物生成少，低運營成本和高效率等優點，逐漸引起了人們的關注。由微流控系統制成的產品可以對現場進行快速、準確的農藥殘留檢測，杭州霆科生物科技有限公司生產的微流控農藥殘留快速檢測系統只需將樣品滴入14通道微流控芯片后，結合便攜式分析儀便可以在10 min內同時檢測多種基質的農藥殘留［54］，對目標農藥的檢測具有較高的特異性和可靠性。

3.3 生物傳感器

生物傳感器是一類將生物信號轉為電信號的高靈敏度傳感器，主要包括比色生物傳感器、電化學生物傳感器、熒光生物傳感器和基于拉曼光譜的生物傳感器等［32］，生物傳感器具有更簡便的操作方法和更高靈敏度的檢測效果，被運用至眾多食品和農產品檢測中。常見的生物傳感器如電化學生物傳感器，通過固定在電極上的酶和底物反應前后產生的電流信號變化得出酶被抑制的程度，抑制程度和農藥濃度在一定濃度范圍內呈線性相關，因此可以檢測出農藥殘留［55］。電化學生物傳感器與傳統的儀器檢測相比具有快速響應、低檢出限和良好的選擇性等特點［56］。

瑞士IST AG公司生產的生物傳感器采用酶法安培測量原理，依靠固定化酶對目標物進行檢測和分析，此外IST AG旗下Jobst Technologies GmbH開發的固定化系統還可以調節敏感度和測量范圍等參數，滿足了對不同目標物的檢測需求。除一些傳統的用于檢測農藥殘留的電化學生物傳感器外，El-Moghazy等［57］制備的電化學免疫傳感器通過檢測3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）的含量可以間接測定擬除蟲菊酯對人體的暴露量。Liu等［58］制備的電化學熒光傳感器對草甘膦的檢測線性范圍為0.001-1.0 μmol/L，檢出限為0.5 nmol/L。

目前越來越多的農藥殘留檢測在向生物傳感器、免疫傳感器和微流控芯片等方向發展，這些快速檢測技術具有媲美傳統檢測技術的同時又耗時短、成本低，而固定化酶又是農藥快速檢測的主要研究內容，本文將參考的由固定化酶原理制備的農藥殘留檢測傳感器進行了列舉，詳細結果見表2。

表2 不同類型傳感器比較Table 2 Comparison of different types of sensors

4 結論

基于酶抑制法原理制備的固定化酶產品在農藥殘留檢測中的應用使檢測速度提高，且檢測能力可以與傳統的儀器檢測性能相當。不同的固定方法可以一定程度實現對酶的固定化。但目前存在的問題是，農藥殘留檢測用酶大部分都局限于一種或者一類酶，即廣泛地使用AChE作為固定化酶源，對于其他酶源的固定化研究還較少。因此對于農藥殘留檢測用酶的固定化研究應重點對不同方法、載體和酶源進行探討，而固定化酶產品運用至農藥殘留檢測中還需要進一步研究和發展。