NCAPG基因的表達上調促進肺腺癌細胞增殖并與不良臨床預后相關

楊飏 廖瑩瑩 陳福濤

連云港市第二人民醫院呼吸與危重癥醫學科，連云港 222000

肺癌仍然是全球癌癥相關死亡的主要原因［1-2］。肺鱗狀細胞癌和肺腺癌是非小細胞肺癌的兩個主要亞型，肺腺癌約占肺癌的40%［3-5］。在過去的幾十年里，盡管肺鱗狀細胞癌的治療已經取得了較大進展，但肺腺癌患者的生存率無顯著提高。

非SMC 凝聚素I 復合亞基G（NCAPG），也稱為CAPG、YCG1 或NY-MEL-3，位于4 號染色體4p15.31。NCAPG 蛋白由1 015 個氨基酸組成，含有非SMC 縮合復合物的亞基，并在細胞有絲分裂和減數分裂過程中穩定染色體結構［6］。NCAPG 是縮合復合物的關鍵亞基，它在I 型拓撲異構酶存在下將正超螺旋DNA 轉化為解螺旋態［7］。最近的研究表明，NCAPG 在多種類型的腫瘤細胞中高表達，促進細胞增殖和遷移。

細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）是絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有調節細胞周期的能力。CDK1 是CDK 家族中最重要的蛋白質，可以促進多種類型癌細胞的細胞周期轉換。并且，多項研究證實CDKs在肺腺癌組織中過度表達［8-11］。

資料與方法

1、TCGA數據庫分析

使用R 語言分析繪制TCGA 數據庫中肺腺癌患者的NCAPG mRNA 基因表達箱式圖。mRNA包用于獲取每個樣本中NCAPG mRNA 的表達數據，dplyr 包用于數據整理，ggplot2 和ggsignif 包分別用于基因表達箱線圖的繪制和統計檢驗。

2、預后分析

通過GEPIA工具（http：//gepia.cancer-pku.cn/）在線繪制總生存期（OS）和無病生存期（DFS）。根據基因表達中位數、95%置信區間將肺腺癌患者分為NCAPG 高表達組和NCAPG 低表達組。使用Kaplan-Meier 繪制生存曲線，并通過Log-rank 檢驗進行統計比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3、免疫組織化學染色（IHC）

將石蠟包埋的組織切成4 μm 貼附于防脫載玻片。切片烘烤后，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合。將載玻片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中并置于微波爐中加熱煮沸10 min進行抗原修復。滴加內源性過氧化物酶，室溫孵育10 min。加入山羊血清并在室溫下孵育15 min以封閉非特異性結合位點。棄去血清后，直接將NCAPG 或CDK1 抗體（NCAPG，1：100 稀 釋，ab251864，Abcam，Cambridge，UK；CDK1，1：100 稀釋，ab18，Abcam）滴加到切片中，置于濕盒，并在4 ℃孵育過夜。PBST洗滌后，加入HRP標記的二抗，室溫孵育15 min。PBS 洗滌后，加入DAB 顯色液進行顯色。蘇木素復染后封片。

4、患者和組織標本

收集2017 年1 月至2019 年12 月在連云港市第二人民醫院確診并接受手術治療的肺腺癌患者的腫瘤組織及鄰近正常組織110 份。所有標本均經過病理醫師確認。收集的病例術前均未接受化療和放療。所有患者術前均簽署知情同意書，本研究經連云港市第二人民醫院倫理委員會批準。

5、細胞培養和獲得穩定敲低細胞系

人肺腺癌細胞系來自中國科學院上海細胞庫。所有細胞培養在含有10%胎牛血清（FBS，04-007-1A，Biological Industries，Beit HaEmek，Israel）和1% 青 霉 素-鏈 霉 素（P1400，Solarbio，北京）的PRMI-1640（21870084，Thermo）中。慢病毒介導的敲低NCAPG 的慢病毒由Sangon（中國上海 ） 合 成 。 NCAPG 的 shRNA 序 列 為 ：5′-CCAGAACCAGGCGAAGCTGGTGG -3′，CDK1 的shRNA為：5′-ATCTACCATACCCATTGACTAAC-3′，陰 性 對 照 的shRNA 序 列 為：5′-CCGACAGCAACGTATCAGCTCGG-3′。將細胞以2×105的密度接種于6孔板中，12 h后，使用慢病毒感染細胞。24 h 后，在完全培養基中加入嘌呤霉素篩選陽性細胞。

6、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）

使用Trizol 試劑（15596026，Invitrogen，Waltham，USA）提取細胞總RNA。隨后，使用First Strand cDNA SynthesisKit（K1621，Thermo，USA）將200 ng 總RNA 逆轉錄為cDNA。引 物 如 下 ： NCAPG 正 向 引 物 ：5′-GAGGCTGCTGTCGATTAAGGA-3′；NCAPG 反 向 引 物：5′-AACTGTCTTATCATCCATCGTGC-3′。β-actin 正 向 引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，β-actin 反 向 引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。以β-actin 作為內參基因進行歸一化，使用2-ΔΔCt計算基因的相對表達。

7、蛋白質印跡

收集細胞并使用RIPA 緩沖液提取總蛋白，使用Bradford 方法進行蛋白定量。30 μg 總蛋白于10%SDS-PAGE 凝膠中電泳后，轉膜到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h 后，加入一抗（NCAPG，1：1 000，ab251864，Abcam；β-actin，1：1 000，ab179467，Abcam），4 ℃孵育過夜。用TBST 緩沖液洗滌后，加入HRP 標記的山羊抗兔的二抗（ab6721，Abcam，1：5 000 稀釋），室溫孵育1 h。然后使用ECL試劑顯色（32132，Thermo，USA）。

8、細胞集落形成實驗

將1×103細胞接種于含有2 ml 完全培養基的6 孔板中。37 ℃，5% CO2培養14 d。使用1 ml 4%多聚甲醛固定細胞集落20 min后，結晶紫染色30 min。

9、CCK-8實驗

將2×103細胞接種于含有200 μl 完全培養基的96 孔板中。37 ℃，5% CO2培 養3 d。然 后，每 孔 加 入20 μl CCK-8 試劑（ab228554，Abcam）孵育2 h。使用酶標儀檢測在450 nm波長處的吸光度。每組設置5個重復孔。

10、腫瘤異種移植瘤模型

18～22 g BALB/c 裸鼠購自北京華阜康生物。5×106A549 細胞與150 μl PBS 緩沖液混合，注射于小鼠腹股溝皮下。3 d 測量1 次腫瘤的長寬徑，體積計算公式為：腫瘤體積=長×寬2/2［12］。

11、基因相關分析和蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）

基于TCGA 數據庫采用Pearson 法計算基因相關系數。NCAPG 相關的蛋白質相互作用網絡使用STRING（https：//string-db.org/）進行可視化。

12、免疫共沉淀（CO-IP）

將5 μg 特異性抗體和30 μl蛋白G-瓊脂糖珠進行孵育形成復合體。收集107細胞進行裂解，將細胞裂解物與抗體復合體在4 ℃下旋轉孵育2 h。然后，將珠子用1.5 ml 冰冷的PBS 洗滌3 次，95 ℃下加熱5 min 洗脫與珠子結合的蛋白質。通過蛋白質印跡分離和分析共沉淀的蛋白。

13、統計學分析

使用SPSS 軟件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）進行統計分析。使用Log-rank 方法判定OS 和DFS 的統計差異。根據NCAPG 表達中位數將肺腺癌患者分為NCAPG 低表達和高表達組。采用卡方檢驗評估110 例患者的臨床病理特征和NCAPG 的表達之間的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1、肺腺癌組織中NCAPG mRNA 和蛋白質的高表達與患者的不良預后相關

本研究下載分析了TCGA 數據庫中肺腺癌和癌旁正常組織（包括483 個肺腺癌組織和347 個對照組織）的數據。基因表達箱線圖顯示，NCAPG 的mRNA 在肺腺癌中過表達，差異有統計學意義（圖1A）。根據肺腺癌中NCAPG 的表達中位數將腫瘤患者分為高表達組和低表達組，分析患者的OS 和DFS，結果顯示，NCAPG 高表達的肺腺癌患者預后較差（圖1B，分別為P=0.000 16、0.009 50）。

然后，我們通過The Human Protein Atlas（https：//www.proteinatlas.org/）數據庫分析了人類多種腫瘤組織中NCAPG蛋白的表達，發現NCAPG 在多種類型的腫瘤中高表達，如結直腸癌和肺癌（圖1C）。

圖1 NCAPG mRNA 和蛋白質水平在肺腺癌中高表達，并與患者的不良預后相關。A：TCGA 數據庫中肺腺癌患者的NCAPG mRNA表達水平。B：Kaplan-Meier 生存曲線顯示NCAPG 高表達組和低表達組之間的OS（P=0.000 16）和DFS（P=0.009 50）存在差異。C：The Human Protein Atlas數據庫中NCAPG在多種類型人類腫瘤中的表達

2、NCAPG在肺腺癌組織中高表達并與臨床病理特征相關

為了進一步檢測NCAPG 在肺腺癌組織中的表達，本研究通過IHC 評估了2016 至2018 年連云港市第二人民醫院110 例肺腺癌患者的NCAPG 表達（表1）。如圖2A 和圖2B所示，與正常肺組織相比，肺腺癌中NCAPG 的表達明顯上調，并且主要位于細胞質中。同時我們獲取了患者的診治信息，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結轉移等。根據IHC 的結果，病理醫師將110例患者分為NCAPG 高表達組和低表達組。卡方檢驗顯示NCAPG 的表達與腫瘤大小和臨床分期相關（P=0.048、0.021）。

圖2 NCAPG 蛋白在110 例肺腺癌患者中過表達。A：IHC 檢測110例肺腺癌組織和鄰近正常組織；B：NCAPG蛋白表達，數據顯示NCAPG蛋白在肺腺癌組織中過表達

表1 110例肺腺癌患者不同NCAPG表達量與臨床病理特征之間的關系（例）

3、敲低NCAPG抑制A549和H1975細胞的增殖

為了研究NCAPG 在肺腺癌進展中的具體機制，本研究在常見肺腺癌細胞中（NCI-H125、Calu-3、A549、H1975）檢測了其mRNA 和蛋白表達。如圖3A 和3B 所示，NCAPG 在A549 和H1975 細胞系中具有較高的表達。因此，選擇A549 和H1975 細胞系進行機制研究。使用慢病毒介導的shRNA 敲低兩種細胞系中NCAPG 的表達，嘌呤霉素篩選以獲得穩定敲低細胞，用于后續的體內外驗證。如圖3C和3D所示，在NCAPG-shRNA 轉染的細胞系中，NCAPG mRNA 和蛋白質表達顯著降低。為了驗證NCAPG 的表達是否與細胞增殖相關，進行了細胞集落形成實驗和增值實驗。CCK-8 實驗進一步證實敲低NCAPG 降低了肺腺癌細胞的增殖能力（圖3E）。另外，敲低NCAPG 顯著抑制了A549 和H1975的集落數量（圖3F）。

圖3 肺腺癌細胞系A549 和H1975 中敲低NCAPG 抑制細胞增殖。A：NCAPG 在多種肺腺癌細胞系中的mRNA 表達水平；B：NCAPG 在肺腺癌細胞系中的蛋白質表達水平；C：使用qRT-PCR 檢測A549和H1975細胞系中敲低NCAPG 后其mRNA 表達量；D：使用免疫蛋白印跡檢測A549和H1975細胞系中敲低NCAPG后其蛋白質表達量；E：CCK-8檢測敲低NCAPG后對A549和H1975細胞增殖能力的影響；F：集落形成實驗驗證敲低NCAPG后對細胞集落形成的影響

4、NCAPG與CDK1相互作用促進肺腺癌進展

NCAPG 在肺腺癌中的分子功能尚不清楚。為了進一步研究NCAPG 在肺腺癌進展中的分子機制，我們通過STRING（https：//string-db.org/）使 用PPI 的 方 法 分 析 了NCAPG 的相關基因。PPI 網絡中共鑒定了27 種相關蛋白質，例如細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1），染色體結構維持蛋白家族（SMC，圖4A）。基于共表達分析和先前的研究，我們發現CDK1 和NCAPG 表達顯著相關（預測分數=0.999）。TCGA 肺腺癌數據庫的共表達分析結果表明，NCAPG 和CDK1 在肺腺癌組織中密切相關（P＜0.01，R=0.73，圖4B）。另外，通過我們收集的110例標本的IHC染色分析進一步證明了兩基因表達的相關性（表2）。另外，我們通過免疫共沉淀（CO-IP）實驗確認它們的結合（圖4C）。此外，蛋白質印跡顯示A549 和H1975 細胞系中敲低CDK1 抑制了NCAPG 的表達（圖4D），表明CDK1 可能在肺腺癌進展過程中調節NCAPG 的表達。為了進一步驗證表達相關性，我們對肺腺癌和正常組織的連續切片進行了IHC 染色。與之前的結果一致，NCAPG 和CDK1在肺腺癌中高表達，在正常組織中低表達（圖4E）。

圖4 肺腺癌中NCAPG與CDK1相互作用促進肺腺癌進展。A：NCAPG在肺腺癌組織中的PPI分析；B：在TCGA肺腺癌數據庫中分析NCAPG 和CDK1 的共表達情況；C：通過CO-IP 測定在A549 細胞中NCAPG 和CDK1 之間的相互結合；D：A549 和H1975 細胞系中CDK1敲低抑制了NCAPG的蛋白質表達；E：通過IHC分析NCAPG和CDK1在人肺腺癌連續組織切片中的共表達

表2 110例肺腺癌患者中NCAPG和CDK1表達相關性分析

5、NCAPG/CDK1促進腫瘤進展并與預后呈負相關

我們進一步檢索了TCGA 肺腺癌數據庫中CDK1 的mRNA 表達，結果顯示與正常組織相比，CDK1 在肺腺癌中顯著過表達，Kaplan-Meier 生存分析顯示CDK1 的表達水平與肺腺癌患者的OS 和DFS（圖5A、圖5B）均呈負相關。我們發現CDK1在多種惡性腫瘤中都有很高的表達，例如甲狀腺癌、結直腸癌和胃癌。數據顯示大約40%的肺腺癌患者表現為CDK1的高表達（圖5C）。另外，我們分析了腎癌、肝癌、胰腺癌和肺癌患者血清中CDK1 的表達情況，結果顯示血清中CDK1高表達的患者總生存率較差（圖5D）。這些數據可能表明NCAPG/CDK1促進了肺腺癌的進展。

圖5 CDK1 在多種腫瘤中高表達并與患者預后呈負相關。A：TCGA 數據庫中肺腺癌組織中CDK1 的mRNA 表達箱線圖；B：肺腺癌患者CDK1 的Kaplan-Meier 生存分析；C：CDK1 在不同類型癌癥中的表達；D：腫瘤患者血清中CDK1 的表達與患者預后相關。數據來自Proteinatlas（https://www.proteinatlas.org）

討 論

惡性腫瘤的特征是不受控制的細胞增殖［13］。凋亡或增殖基因的突變或拷貝數變化影響細胞分裂和分化。雖然多種治療方法不斷取得進展，提高了肺腺癌患者的生存率，但晚期患者的預后仍然較差。研究與肺腺癌細胞增殖相關的蛋白質有利于開發新的生物標志物和治療靶點。

NCAPG 作為凝集素Ⅰ的亞基，對維持染色質的結構穩定性至關重要［14］。凝集素家族有兩個成員：凝集素Ⅰ和凝集素Ⅱ。凝集素Ⅰ和凝集素Ⅱ在有絲分裂中發揮不同的作用。凝集素Ⅰ在有絲分裂間期存在于細胞質中，并在核膜破裂（NEBD）后進入染色體［15-19］。凝集素Ⅱ在有絲分裂間期存在于染色體中并介導染色體的早期壓縮［20-24］。NEBD后，凝聚素Ⅰ參與進一步的染色體收縮以促進有絲分裂。

研究表明，NCAPG 參與了多種腫瘤的發病機制，包括前列腺癌［25-27］、肝細胞癌［28-30］、結直腸癌［31-32］、子宮內膜癌［33-34］、腎透明細胞癌［35-37］。通過生物信息學方法，我們發現肺腺癌組織中NCAPG 的mRNA 和蛋白質過表達。通過Kaplan-Meier 分析，我們發現腫瘤標本中NCAPG 高表達的患 者OS 和DFS 較 差。Li 等［38］通 過 對 來 自GSE19188 和GSE33532的76個肺腺癌組織和配對正常組織的分析，鑒定了8 個與預后高度相關的基因，其中包括NCAPG。線性預后模型和多變量Cox 回歸分析表明，NCAPG 高表達的患者OS較差。該結論在連云港市第二人民醫院110例肺腺癌患者中得到進一步驗證。

為了進一步研究NCAPG 促進肺腺癌進展的機制，我們建立了穩定敲低NCAPG 的肺腺癌細胞系。我們首先進行了集落形成和CCK-8實驗，數據顯示NCAPG 促進了肺腺癌細胞增殖。與我們的結果相似，NCAPG 在體外和體內促進肝細胞癌細胞增殖［28，39-40］。

CDK1 是種間高度保守的蛋白質，促進細胞有絲分裂。CDK1促進了腫瘤進展并與患者的預后呈負相關。通過PPI和共表達分析，我們發現CDK1 和NCAPG 在肺腺癌組織中可能存在相互作用。腫瘤組織和對照組織連續切片IHC 實驗進一步證明CDK1和NCAPG具有表達相關性。

NCAPG 已在多種類型的癌癥中被確認為致癌基因。此前，研究人員使用生物信息學方法證明NCAPG 是影響LUAD 預 后 的 因素［38］。我們首次驗證了NCAPG 通過與CDK1 的相互作用促進細胞增殖。因此，NCAPG 可作為肺腺癌預后不良的標志物和治療靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突