外源赤霉素GA3施加對紫花苜蓿-根瘤菌共生體系的影響

何玉娟, 李東琴,2, 鄧 波*, 楊 軍, 對山艾力·卡布吐拉, 楊 超

(1.中國農業大學草業科學與技術學院， 北京 100193； 2.甘肅省酒泉市林果服務中心， 甘肅 酒泉 735000； 3.烏魯木齊綠之園園林開發有限公司， 新疆 烏魯木齊 830000； 4.特克斯縣林業和草原局， 新疆 特克斯 8355005； 5.天山西部國有林管理局特克斯分局， 新疆 特克斯 835500)

在根瘤菌與植物的共生過程中，植株為了平衡碳水化合物的支出與氮素收入，會通過生長素、赤霉素、細胞分裂素、乙烯以及脫落酸等植物激素進行局部調控[1]。其中，赤霉酸(Gibberellins或Gibberellic acid,GA)是基于赤霉烷結構的一類植物激素，是典型的植物生長調節劑，參與細胞分裂和種子發芽等生理過程[2]，根瘤菌的侵染、根瘤原基的建立和根瘤結構的成熟都需要GA[3]。有研究發現植物形成根瘤的不同階段合成GA基因上調，表明結瘤期間GA作用于植物根毛卷曲、侵染線和根瘤原基的形成[4-5]。大豆(Glycinemax)接種根瘤菌12 h后，參與GA合成的基因顯著上調，增加早期結瘤過程中活性GA的水平[3,6]，而田菁(Sesbaniarostrata)和百脈根(Lotusccorniculatus)根瘤中結瘤的后期階段GA的合成基因上調[4-5]。接種根瘤菌之前，用GA生物合成抑制劑作用于蕓扁豆(PhaseoluslunatusL.)和田菁(Sesbaniarostrata)可抑制或完全阻斷根瘤的形成[4,7]。Dobert等和Lievens等分別發現赤霉素和G420氧化酶基因在蕓扁豆(PhaseoluslunatusL.)和田菁的根瘤、細菌侵染線和前感染區中有較強表達力[7]。此外，外源施加GA可彌補內源GA的不足或缺失，即在合適的條件下，外源GA可發揮與內源GA同樣的作用，外源施加GA能夠促進結瘤[8]，現在已鑒定出赤霉素的形式有130多種，但是僅僅只有幾種具有生物活性，如真菌產物赤霉素GA3或赤霉酸。Ferguson發現赤霉素GA生物合成變異株形成根瘤數顯著少于野生型，當赤霉素信號途徑受損時，豌豆(Pisumsativum)突變株的根部結瘤過程受到抑制，外源加入GA時，結瘤數目又恢復正常[9]。但也有研究結果顯示，在百脈根結瘤過程中，赤霉素信號途徑的正調控因子LjSLEEPYl基因的過表達顯著減少了百脈根的結瘤數；外源施加GA抑制了在表皮發生的根毛卷曲現象，并且抑制了NSP2和NIN的表達[5]。引起這種差異的原因可能是豆科植物種類、植株生長條件、應用技術以及赤霉素的形態和濃度等[3]，過高或過低濃度的赤霉素都會抑制根瘤的形成。

目前，赤霉素在結瘤過程中的作用主要集中在大豆、田菁等一年生植物上，對于外源施加不同濃度梯度赤霉素對紫花苜蓿結瘤過程的影響鮮見報道。本研究通過外源添加赤霉素于苜蓿-根瘤菌共生體系中，研究其對苜蓿-根瘤菌結瘤效果的影響，并進一步探究外源赤霉素對苜蓿結瘤過程中具體的作用階段。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本文所用苜蓿品種為‘中苜1號’(MedicagosativaL. ‘Zhongmu No. 1’)，由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究提供。苜蓿中華根瘤菌gfp-Sm1021(抗400 mg·L-1硫酸鏈霉素(str)及80 mg·L-1壯觀霉素)由中國農業大學生命科學學院國家農業生物技術國家重點實驗室提供，赤霉素GA3購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司Sigma官網。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1外源赤霉素對苜蓿-根瘤菌共生體系結瘤效果的影響試驗 采取試管培養的方式，將發芽的種子以無菌操作方式播于裝有濾紙條的試管，在幼苗根尖施加20 μL濃度梯度為10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10mol·L-1的GA3，以不施GA3為對照，共10個濃度，每種濃度3個重復，每個重復5株，共150株。隨后接種處理好的苜蓿根瘤菌50 μL(根瘤菌采用YEM液體培養基，溫度28℃，180 r·min-1振蕩培養，根瘤菌培養至48 h對數生長穩定期)，并加滅菌的Fahraeus無氮營養液15 mL，置于22～28℃溫室中培養，每天光照16 h。接種后第10 d開始記錄根瘤數量，每隔5 d記錄一次，直至第35 d天，培養至第20 d記錄植株莖長和根長。

1.2.2外源赤霉素對根毛卷曲和根瘤原基的影響試驗 選取長勢一致的幼苗轉移到帶濾紙的方形培養皿，每個培養皿放置4株幼苗，幼苗根系施用 0(對照)、10-5和10-9mol·L-1的GA3溶液20 μL，隨后接苜蓿根瘤菌50 μL，以開始接種起記為0 h，每個處理10個重復，共計30株幼苗。接種48 h后，利用體式顯微鏡(OLYMPUS SZX18)觀測根毛卷曲的整體趨勢，隨后放于光學顯微鏡(OLYMPUS BX53)10倍鏡下，隨機選取10個連續不重復的視野，數出總根毛數以及卷曲根毛數，用Camon DS126 271拍照開始觀察根毛卷曲情況；接種72 h后，開始觀察根瘤原基發育情況。依次進行取材、脫水、包埋后將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，片厚4 μm。切片漂浮于攤片機40℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，放進60℃烘箱內烤片，待水烤干蠟烤化后經HE染色、脫水封片將切片從二甲苯溶液中取出稍晾干，中性樹膠封片。置于Nikon Eclipse ci顯微鏡鏡檢，圖像分析用Nikon DS-U3采集。染色結果為：細胞核藍色，細胞質紅色。

1.2.3外源赤霉素對根系分泌木犀草素的影響試驗 選取幼苗根系長至2～3 cm左右的苜蓿，轉移到大搪瓷盤，根系施用0(對照)、10-5和10-9mol·L-1的GA3溶液20 μL，隨后接苜蓿根瘤菌50 μL，以開始接種起記為0 h，在接種后12 h，24 h，36 h，48 h進行取樣，剪去苜蓿幼苗根稱取0.75 g鮮樣，在液氮中迅速將材料充分研磨成粉末狀，把粉末轉移至2.5 mL離心管中，加入2 mL 80%的乙醇提取液，超聲提取4 h，13 400 r·min-1離心15 min，將上清液轉入2 mL離心管中，用0.45 μm濾膜過濾樣品，利用高效液相色譜檢測木樨草素含量。每個處理10個重復，共計30株幼苗。

1.2.4外源赤霉素對根瘤菌生長的影響試驗 在濃度為10-5mol·L-1和10-9mol·L-1的YMA液體培養基中接入苜蓿根瘤菌種子液5 mL，以未添加GA3處理為對照，每隔6 h測定各處理菌液吸光度值(Optical density)和pH值，測量時間為6 h，12 h，18 h，24 h，30 h，36 h，42 h，48 h，54 h，60 h，66 h，72 h，每個處理3個重復，共108瓶。用分光光度計(UH5300)在600 nm處測量各處理菌液OD值，pH值采用pH計(PB-10)測定；采用乙烯還原法測定根瘤菌的固氮酶活性，在濃度為10-5mol·L-1和10-9mol·L-1的LNB5液體培養液中按1%接種量接種苜蓿根瘤菌，隨后用橡膠瓶塞密封，再用封口膜密封一次，用注射器吸出1 mL空氣，然后注入等體積的乙炔,再次用封口膜密封一次，培養24 h后，利用島津GC-2010氣相色譜儀測定乙烯生成速率。

1.2.5外源赤霉素對苜蓿根瘤菌相關基因的影響試驗 用濃度為10-5mol·L-1和10-9mol·L-1GA3處理苜蓿根瘤菌后，采用TriZol法進行總RNA提取；并采用定量檢測(儀器：BioTek-Epoch)和瓊脂糖熒光定量檢測對苜蓿根瘤菌提取的RNA進行質量鑒定；對苜蓿根瘤菌反轉錄制備cDNA稀釋30倍后作為模板，采用ABI 7 500 Real Time PCR儀(美國Applied Biosystem公司)進行Real-Time PCR擴增(表1，表2)。

表1 Real-Time PCR反應體系Table 1 The reaction system of Real-Time PCR

表2 熒光定量PCR引物Table 2 Primers developed in this study

1.3 數據分析

運用Excel整理數據，制作相關圖表；采用SPSS 19.0 軟件對所測數據進行統計和分析；苜蓿根瘤菌cDNA進行Real-Time PCR擴增數據分析采用SDS2.3(美國Applied Biosystem公司)分析。

2 結果與分析

2.1 外源赤霉素對苜蓿-根瘤菌共生體系結瘤效果的影響

2.1.1根瘤數的變化 植株根瘤數隨著生長時間的增加均呈現增加的趨勢，在同一時間(天)內，隨著赤霉素濃度的降低，植株結瘤數呈現出先增大后降低的變化趨勢(P<0.05，表3)。當外源赤霉素的稀釋濃度為10-9mol·L-1時，苜蓿根瘤數最多，顯著大于對照根瘤數(P<0.05)；稀釋濃度為10-10mol·L-1時，苜蓿根瘤數降低，與對照無顯著性差異；外源赤霉素濃度為10-6～10-2mol·L-1時的根瘤數顯著少于對照(P<0.05)。稀釋濃度10-7mol·L-1和10-8mol·L-1時，植株結瘤數與對照無顯著性差異。

表3 不同濃度GA3對根瘤數的影響Tabel 3 Effects of different concentrations of GA3 on nodule number

2.1.2干鮮重的變化 植物的生長與氮素的吸收和利用密切相關，干鮮重是描述苜蓿產量的重要指標。圖1顯示，隨著外源赤霉素稀釋濃度的降低，植株干重和鮮重的變化趨勢一致，都呈現出先增大后降低的變化趨勢(P<0.05)。當外源赤霉素的濃度為10-9mol·L-1時，植株干重和鮮重最大，顯著大于對照(P<0.05)；當外源赤霉素的稀釋濃度增大到10-10mol·L-1時，植株干重和鮮重降低，與對照無顯著性差異，顯著小于10-9mol·L-1(P<0.05)。外源赤霉素濃度為10-6～10-2mol·L-1時，植株干重與鮮重顯著小于對照(P<0.05)。10-7mol·L-1和10-8mol·L-1赤霉素處理的植株干鮮重與對照無顯著差異。

圖1 不同濃度GA3處理對幼苗干重(A)、鮮重(B)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of GA3 on plant dry (A) and fresh weight(B)

2.1.3外源赤霉素對苜蓿-根瘤菌共生體系幼苗根長和莖長的影響 赤霉素可以刺激莖的節間伸長，促進細胞分裂和細胞伸長。隨著外源赤霉素濃度的逐漸降低，植株根長(圖2 A)表現為先升高后降低的變化趨勢(P<0.05)，莖長(圖2 B)表現為逐漸降低的變化趨勢。外源赤霉素的稀釋濃度為10-2mol·L-1和10-3mol·L-1時，苜蓿-根瘤菌共生體系莖長顯著大于對照(P<0.05)，濃度10-2mol·L-1和10-3mol·L-1間無顯著性差異；當外源赤霉素的濃度為10-9mol·L-1時，苜蓿-根瘤菌共生體系根長顯著大于10-2mol·L-1和10-3mol·L-1時的根長(P<0.05)，但與對照無顯著性差異。

圖2 不同濃度GA3處理對幼苗根長(A)、莖長(B)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of GA3 on plant shoot(A) and root length(B)

2.2 外源赤霉素對根瘤原基和根毛卷曲的影響

根瘤原基數量隨著赤霉素濃度發生變化(圖3)，10-9mol·L-1GA3處理下，根瘤原基數量顯著多于對照(P<0.05)，10-5mol·L-1GA3處理下根瘤原基數量雖然減少，但是與對照相比差異不顯著。

圖3 不同濃度的GA3對根瘤原基的影響Fig.3 The effect of different concentrations of GA3on nodule primordium

由染色切片結果可以看出，接種72 h后，10-9mol·L-1GA3處理下，根部皮層位置區域有藍色細胞核的聚集，細胞分裂活躍，且聚集數量較多(圖4)；10-5mol·L-1GA3處理下，并無明顯的藍色細胞核聚集，細胞分裂不活躍。

圖4 用10-5與10-9 mol·L-1 GA3處理根瘤原基情況(接種后72 h)Fig.4 Root hairs treated with 10-5,10-9 mol·L-1 GA3(Analysis was preformed 72 h after inoculation)

與對照相比，10-5mol·L-1的GA3處理植株根系后，根毛卷曲率顯著降低(P<0.01)，10-9mol·L-1GA3處理后，與對照差異性不顯著。10-5mol·L-1的GA3處理植株根毛卷曲率與對照相比下降93.47%，10-9mol·L-1GA3處理根毛卷曲率下降14.71%(圖5，圖6)。

圖5 不同濃度的GA3對根毛卷曲的影響Fig.5 The effect of different concentrations of GA3on root hair deformation

圖6 用10-5和10-9 mol·L-1 GA3處理后根毛卷曲情況(接種后48 h后分析顯微鏡20倍鏡下觀察結果)Fig.6 Root hairs treated with 10-5,10-9 mol·L-1 GA3(Analysis was preformed 48 h after inoculation)

2.3 外源赤霉素對根系分泌木犀草素的影響

在接種根瘤菌后，隨著時間的增加，植株根系分泌木犀草素的含量呈現先增加后減少的趨勢，在第36 h左右達到最大。與對照相比，10-9mol·L-1GA3處理下木犀草素含量顯著增高(P<0.05)，10-5mol·L-1GA3處理下木犀草素含量與對照相比差異不顯著(表4)。

表4 不同濃度GA3處理對苜蓿根部木犀草素含量的影響Table 4 Effect of shoot-applied GA3 on the component of luteolin in afalfa roots 單位：μg·g-1

2.4 外源赤霉素對苜蓿根瘤菌生長的影響

2.4.1根瘤菌數量的變化 如圖7所示，培養24 h后，當培養基中添加10-9mol·L-1GA3時，苜蓿根瘤菌的數量與對照相比無顯著差異，然而10-5mol·L-1GA3處理的苜蓿根瘤菌的數量顯著下降(P<0.05)。培養72 h后，外源添加GA3處理的苜蓿根瘤菌數量均高于對照(P<0.05)，10-5mol·L-1GA3處理下的苜蓿根瘤菌OD值達到0.96，而10-9mol·L-1GA3處理下的苜蓿根瘤菌OD值為1.16。

圖7 不同濃度的GA3對苜蓿根瘤菌OD值的影響Fig.7 Effects of different concentrations of GA3 on the OD value of rhizobium alfalfa

2.4.2根瘤菌pH的變化 如圖8所示，在培養的72 h內，經GA3處理的苜蓿根瘤菌pH始終低于對照。然而，10-5mol·L-1GA3處理下，雖然在培養過程中的pH維持在6～7之間，但是該處理的pH下降速度也快于低濃度10-9mol·L-1GA3處理下的pH降低速度，且兩種處理下在第36 h下降的最快。

圖8 不同濃度的GA3對苜蓿根瘤菌pH值的影響Fig.8 Changes in pH value during the process of sinorhizobium meliloti culturing in different concentration of GA3

2.4.3根瘤菌固氮酶活的變化 未經GA3處理的苜蓿根瘤菌固氮酶活性平均值為0.21 μL·mL-1·d-1。而在培養基中添加10-9mol·L-1GA3處理的苜蓿根瘤菌固氮酶活性平均值上升至0.24 μL·mL-1·d-1，上升了14.3%，達到顯著水平(P<0.05)，而10-5mol·L-1GA3處理下與對照相比差異不顯著(圖9)。

圖9 不同濃度的GA3對苜蓿根瘤菌固氮酶活性的調控Fig.9 Effect of GA3 on nitrogenase activity of alfalfa rhizobium

2.5 外源赤霉素對苜蓿根瘤菌相關基因的影響

經10-9mol·L-1GA3處理的苜蓿根瘤菌的nodA，nodD，nifA，nifH，fixA，fixK基因相對表達量均上調，且與對照相比有顯著性差異(P<0.05)，而經10-5M GA3處理的苜蓿根瘤菌的nodA，nodD，nifA，nifH，fixA，fixK基因相對表達量與對照相比無顯著性差異，說明適當濃度的GA3可以刺激根瘤菌基因的表達(圖10)。

圖10 苜蓿根瘤菌nod A，nod D，nif A，nif H，fix A，fix K基因熒光定量PCR相對表達量Fig.10 Relative expression of quantitive-time PCR for nod A，nod D，nif A，nif H，fix A，fix K from Sinorhizobium meliloti

3 討論

3.1 外源赤霉素添加對紫花苜蓿結瘤過程的影響

根毛是根系特異表皮細胞外伸形成的管狀突出物，位于根尖且具有結瘤活性的植物根毛可以識別根瘤菌分泌的nod因子，引發鈣離子振蕩，使細胞骨架發生改變，最終引起根毛卷曲[10]，本研究發現10-5mol·L-1GA3的赤霉素能夠抑制根毛卷曲，這與Maekawa研究結果一致[5]，但10-9mol·L-1GA3的赤霉素并沒有促進根毛卷曲的發生。植物根毛識別結瘤因子后，位于G0/G1期的內皮層細胞隨即開始分裂，形成根瘤的起始原基，隨后，植株根系中皮層細胞分裂分化，形成根瘤原基[11-12]。本研究結果表現為10-9mol·L-1GA3促進根瘤原基的形成，10-5mol·L-1GA3對根瘤原基的形成并無影響，Maekawa研究發現高濃度10-6mol·L-1GA3處理抑制百脈根根瘤原基的形成[5]。這可能是因為不同根瘤類型對不同濃度的GA3響應不一樣，苜蓿形成的為無限根瘤，而百脈根形成有限根瘤，赤霉素在兩種類型根瘤形成中扮演著相反的作用。

類黃酮物質是誘導根瘤菌結瘤因子表達的主要物質，其含量的增加能在一定程度上促進根瘤菌結瘤因子的表達，進而引起一系列結瘤相關的生理生化反應，促進結瘤發生[13-14]。當固氮調控基因與寄主分泌的誘導物質類黃酮化合物木犀草素反應結合后，結瘤基因才能表達，結瘤基因的表達產物能夠合成一種稱為結瘤因子的物質，它能誘導植物根毛發生一系列的形態和生理方面的變化，最終促進根瘤的形成[15-16]。本研究結果表明在10-9mol·L-1GA3處理下，木犀草素含量顯著性增加，然而10-5mol·L-1GA3處理下，能夠抑制木犀草素的分泌。隨著GA3處理時間的增加，10-9mol·L-1GA3處理組的木犀草素合成量逐漸增加，而且比對照組高，這與馮思瓊研究結果一致[17]，表明10-9mol·L-1GA3處理能促進植物根部次級代謝物異黃酮的分泌。

影響和決定根瘤菌共生固氮效率的因素來自土壤生態環境、宿主植物和根瘤菌三個方面。在本研究中，我們發現外源添加10-9mol·L-1GA3可提高根瘤菌的固氮酶活性，對苜蓿根瘤固氮酶活性產生直接影響。10-5mol·L-1GA3處理下的苜蓿根瘤菌在其培養過程中伴隨著pH的迅速下降，根瘤菌的生長速率表現出下降和減慢的趨勢，我們分析這可能是GA3培養基pH動態下降導致生長速率下降，而且根瘤菌的發育受到添加到培養基中的GA3濃度的直接調控，這與周圣驕等的研究結果一致[18]，他發現適宜濃度GA3可使大豆根瘤菌在培養基的生長速率和數量顯著提高。豆科牧草的結瘤數量是決定固氮效率的關鍵因子，也是涉及到牧草產量和品質的重要農藝性狀，本試驗研究結果表明，從接種第10 d到第35 d的苜蓿根瘤數整體變化都呈現出先增大后降低的變化趨勢。接種第35 d后，10-9mol·L-1GA3處理顯著增加苜蓿根瘤數，10-5mol·L-1GA3處理根瘤數顯著減少，說明通過外源添加10-9mol·L-1GA3可促進根瘤的形成。

3.2 外源赤霉素添加對苜蓿根瘤菌相關基因表達的影響

4 結論

10-9mol·L-1的外源赤霉素的添加可促進nod基因的表達，增加植株根系黃酮類物質的分泌量，誘導形成更多且活性更強的根瘤原基，提高苜蓿根瘤結瘤數。