復合添加劑對花生秧青貯品質的影響

田吉鵬， 韋 青， 劉蓓一， 許能祥， 丁成龍， 顧洪如

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結合重點實驗室， 江蘇 南京 210014)

花生(ArachishypogaeaLinn.)在我國廣泛種植，每年產(chǎn)量達1 700多萬t。花生收獲后剩余的花生秧具有豐富的營養(yǎng)物質且瘤胃消化率高，十分適合被反芻動物利用。據(jù)研究，花生秧在瘤胃的干物質及粗蛋白降解率均顯著高于豆秸、玉米秸等其他秸稈[1]。飼喂花生秧可以提高畜禽生產(chǎn)性能和胃腸道消化功能、維持腸道菌群平衡，提高免疫力[2]。我國黃淮海地區(qū)反芻動物舍飼養(yǎng)殖規(guī)模龐大，優(yōu)質牧草資源缺乏，同時也是我國花生的主產(chǎn)地。充分利用花生秧飼料資源可以有效解決優(yōu)質粗飼料短缺的難題，保證我國黃淮海農(nóng)區(qū)反芻動物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

青貯是保存粗飼料營養(yǎng)成分、提高消化率的有效手段。花生屬于豆科植物，緩沖能值高，可溶性碳水化合物含量低，附著乳酸菌數(shù)量少，難以有效青貯。同時花生品種較多，不同品種花生秧營養(yǎng)品質差異較大[3]，也增大了花生秧青貯飼料添加劑的應用難度。現(xiàn)有研究多將狼尾草(Pennisetumalopecuroides(L.) Spreng.)、全株玉米(ZeamaysL.)、高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench)等與花生秧進行混合青貯[4-6]。添加外源乳酸菌及農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物同樣能夠提高青貯發(fā)酵質量,抑制有害微生物，在花生秧以及苜蓿等豆科青貯飼料中取得良好的效果[7-8]。玉米芯是玉米果穗脫去籽粒后的穗軸，營養(yǎng)成分豐富，與其他原料通過混合青貯能夠提高青貯飼料質量和反芻動物的生產(chǎn)性能[9]。稻殼粉(OryzasativaL.)營養(yǎng)成分含量少，但是添加進花生秧青貯中能夠降低緩沖能值，提高干物質含量，提高青貯發(fā)酵效果[10]，同時經(jīng)過發(fā)酵亦可提高稻殼粉營養(yǎng)價值和消化率[11]。目前尚未有花生秧與玉米芯或稻殼粉混合青貯的相關報道。本研究將花生秧與玉米芯或稻殼粉進行混合青貯，同時添加復合乳酸菌制劑，旨在探索針對不同花生秧品種的最佳復合添加劑組合,以提高花生秧青貯的成功率和發(fā)酵質量，為花生秧的飼料化利用提供理論依據(jù)及技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生秧來自于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院試驗地，花生品種為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院培育的品種‘027’(H1品種)和‘047’(H2品種)，花生收獲期收獲，留茬高度5 cm。乳酸菌采用江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧所自研復合乳酸菌，主要菌種包括植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)，活菌數(shù)>5×1010CFU g-1。玉米芯和稻殼粉自當?shù)厥袌鲑彽谩?/p>

1.2 試驗設計

試驗采用雙因素完全隨機設計，兩個花生秧品種H1和H2，每個品種分別用蒸餾水(CK組)，復合乳酸菌(LAB組)，復合乳酸菌及玉米芯(LAB+C組)，復合乳酸菌及稻殼粉(LAB+R組)進行處理，每個處理3個重復。

將新鮮收割的花生秧用鍘刀均勻切割為2～3 cm的小段并混合均勻。將復合乳酸菌加入2 mL滅菌脫脂奶粉溶液中室溫活化2 h，加入適量水(20 mL)溶解均勻噴灑進青貯料中。其中CK組和LAB組每個品種取1 kg，分別均勻噴灑等量蒸餾水及乳酸菌液，其中乳酸菌的添加量為5×105CFU·g-1，CK組用蒸餾水等量噴灑。LAB+C和LAB+R組中各自添加花生秧鮮樣5%的玉米芯和稻殼粉，每份1 kg，并均勻噴灑乳酸菌液，乳酸菌的添加量與LAB組相同。將每份1 kg均勻分為3份分別裝入青貯袋中并用真空包裝機抽取真空密封后作為3個重復。全部完成后放入20～25℃儲藏室中包裹黑色塑料袋遮光儲存1年。

1.3 測定項目及方法

1.3.1發(fā)酵品質測定 開封后每個青貯袋中青貯飼料混合均勻，從中均勻取20 g青貯料加入250 mL錐形瓶中，加入180 mL蒸餾水，放入4℃冰箱中浸提24 h，浸提后用4層紗布和定性濾紙過濾，用于pH值的測定，剩余浸提液立即保存于—20℃冰箱中用于氨態(tài)氮和有機酸含量的測定。其中pH值的測定采用梅特勒公司的玻璃電極pH計進行測量。采用安捷倫公司的高效液相色譜儀(配備紫外檢測器)測定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量[12]。分析條件如下：色譜柱為Shodex RSpak KC-811S-DVB gel C(8.0 mm×30 cm，島津公司)；進樣體積為5 μL；流動相為3 mM HClO4；流速為1 mL·min-1；柱溫為60℃；檢測波長為210 nm；運行時間20 min。采用苯酚-次氯酸鈉法測定氨態(tài)氮含量[13]。

1.3.2微生物數(shù)量測定 青貯袋開封后立即稱取測定微生物數(shù)量所需樣品，取每個樣品后更換一次性PE手套和無菌取樣袋。取混合均勻的20 g樣品放入250 mL錐形瓶中，加入180 mL滅菌生理鹽水，室溫條件下在振蕩器中震蕩30 min后立即用于乳酸菌、酵母菌和霉菌的計數(shù)。無菌條件下用移液槍吸取1 mL混勻的菌懸液加入裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中震蕩均勻，反復稀釋得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的菌懸液。用MRS培養(yǎng)基(北京陸橋技術有限公司)對乳酸菌進行計數(shù)，平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)48 h，選擇乳酸菌菌落數(shù)在30～300內的稀釋度培養(yǎng)皿計數(shù)。用孟加拉紅培養(yǎng)基(北京陸橋技術有限公司)對酵母菌和霉菌進行培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d，選擇酵母菌菌落數(shù)在30～300內的稀釋度培養(yǎng)皿計數(shù)，選擇霉菌菌落數(shù)在10～100內的稀釋度培養(yǎng)皿計數(shù)。

1.3.3營養(yǎng)品質和體外消化率測定 取250 g樣品放在105℃烘箱中殺青15 min，然后65℃烘箱中烘干約48 h至恒重，稱重計算干物質(Dry matter，DM)含量，烘干后樣品粉碎過1 mm篩并用于營養(yǎng)品質和體外消化率的檢測。采用凱式定氮法檢測總氮(Total nitrogen，TN)含量[14]，粗蛋白含量以TN×6.25進行計算。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量采用安康公司的Ankom200i纖維檢測儀進行檢測，測定方法為范式法[14-15]。采用體外降解法測定干物質的體外降解率(Invitrodigestibility of dry matter，IVDMD)，具體采用胃蛋白酶-纖維素酶測定法[16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

相關試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行初步整理和分析，用SPSS 20數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行進一步分析。利用一般線性模型對品種(H)、添加劑(A)以及交互效應(H×A)進行方差分析。交互效應顯著的(P<0.05)進一步進行多重比較，多重比較方法采用Tukey法，交互效應不顯著但主效應顯著的(P<0.05)進一步對總體均值進行多重比較，多重比較方法同樣采用Tukey法。各處理以“平均值±標準差”來進行表示。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵品質分析

花生秧青貯飼料發(fā)酵品質相關數(shù)據(jù)見表1。從總體均值上看，H1和H2品種在pH值、乳酸和乙酸含量以及乳酸/乙酸比值上存在顯著差異(P<0.01)。同樣，添加劑的使用在pH值、乙酸含量、乳酸/乙酸比值和氨態(tài)氮含量上具有顯著差異(P<0.01)。花生品種和添加劑的交互效應(H×A)顯著影響了花生秧青貯飼料的各項發(fā)酵指標(P<0.01)。與CK相比H1品種中LAB，LAB+C和LAB+R處理均能有效降低青貯飼料的pH值。H2品種中只有LAB+C處理組的pH值顯著低于CK組(P<0.05)。H1品種中LAB+C、LAB+R處理組的乳酸含量較高，均超過6.3%DM，顯著高于H2品種中的同樣添加劑組合(P<0.05)。LAB+C和LAB+R處理組的乙酸含量在H1品種和H2品種中均顯著低于LAB處理組(P<0.05)，但只有在H2品種中顯著低于CK組(P<0.05)。H2品種的CK組和LAB組具有較高的乙酸含量(P<0.05)。H1品種的LAB+C處理組具有最高的乳酸/乙酸比值(P<0.05)，顯著高于H1品種的CK組和其他添加劑組(P<0.05)。H2品種的LAB+C和LAB+R處理組的乳酸/乙酸比值也顯著高于H2品種的CK和LAB組(P<0.05)。H1品種的CK組以及H2品種的CK組和LAB組氨態(tài)氮含量最高，超過了13%TN。LAB+C和LAB+R處理組在H1和H2品種中相比于CK組均能顯著降低氨態(tài)氮含量，其中LAB+C組效果最好，在H1和H2品種中均低于10%TN。H2品種中的LAB+C組具有最低的氨態(tài)氮含量，為8.17%TN。丙酸和丁酸在本次研究中未檢出。

表1 不同品種和添加劑對花生秧青貯飼料發(fā)酵品質的影響Table 1 The influence of different varieties and additives on the fermentation quality of peanut vine silage

2.2 微生物數(shù)量分析

由表2可知，不同品種乳酸菌數(shù)量和霉菌數(shù)量存在顯著差異(P<0.01)，而添加劑的使用從總體上對乳酸菌、酵母菌和霉菌數(shù)量也有顯著影響(P<0.01)。品種和添加劑的互作效應對于乳酸菌和霉菌數(shù)量具有顯著影響(P<0.01)。H1品種的LAB處理組具有最高的乳酸菌數(shù)量，且顯著高于CK組(P<0.05)，但在H2品種中LAB組與CK組無顯著差異。在兩個品種中LAB+C以及LAB+R處理組乳酸菌數(shù)量顯著低于CK組和LAB組(P<0.05)。H1品種的LAB+R組從數(shù)值上看具有最小的乳酸菌數(shù)量。添加劑的使用能夠顯著影響酵母菌數(shù)量(P<0.01)。LAB+R和LAB+C處理組酵母菌的總體均值分別為1.78和2.67 lgCFU·g-1，相比于CK組和LAB組的總體均值0.71和0.78 lgCFU·g-1，顯著提高了酵母菌數(shù)量(P<0.05)。青貯后H1品種花生秧青貯霉菌數(shù)量未檢出，只有H2品種的LAB+C處理組有少量霉菌檢出，但數(shù)量極少。

表2 不同品種和添加劑對花生秧青貯飼料微生物數(shù)量的影響Table 2 The influence of different varieties and additives on the microbial counts of peanut vine silage

2.3 營養(yǎng)品質分析

由表3可知，兩個品種的青貯飼料在干物質、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質素含量方面均具有顯著性差異(P<0.01)，而添加劑對于花生秧青貯飼料的干物質含量、粗蛋白、酸性洗滌木質素含量以及體外干物質消化率具有顯著影響(P<0.01)，但是僅在干物質含量上品種和添加劑具有顯著的交互效應(P<0.05)。H1組干物質含量和粗蛋白含量顯著高于H2組(P<0.01)，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質素含量顯著低于H2品種(P<0.01)。添加劑LAB+C和LAB+R組顯著增加了青貯飼料的干物質含量(P<0.01)，顯著降低了青貯飼料的粗蛋白含量(P<0.01)。H1品種的CK組和LAB組粗蛋白含量較高，超過11.4%。添加劑LAB+C具有最低的酸性洗滌木質素含量，且顯著低于LAB+R處理組(P<0.05)。從整體上看，添加劑的添加對于中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量無顯著影響。體外干物質消化率在青貯后總體保持平穩(wěn)，不受品種的影響。添加劑尤其是LAB組和LAB+C組相比CK組能夠顯著提高體外干物質消化率(P<0.05)。

表3 不同品種和添加劑對花生秧青貯飼料營養(yǎng)品質和體外消化率的影響Table 3 The influence of different varieties and additives on the nutrition value and in vitro digestibility of peanut vine silage

3 討論

在花生秧青貯飼料中未檢出丙酸和丁酸，這表明丙酸菌和丁酸菌的發(fā)酵受到了抑制。同時酵母菌和霉菌的數(shù)量也很少。整體花生秧青貯飼料中以乳酸菌發(fā)酵為主。在長時間的青貯過程中所有處理的花生秧青貯飼料均得到了很好的保存。一般我們認為青貯飼料的pH值最好低于4.2[17]，但是對于豆科植物來說，由于其成分復雜，蛋白質含量較高，很難使其pH值低于4.2[7]，只要能夠有效抑制梭菌、酵母菌和霉菌等的活動，仍能得到發(fā)酵質量良好的青貯料。在花生秧中添加乳酸菌制劑和農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物能夠有效降低青貯飼料的pH值，這與Qin等[8]的研究相一致。本研究中LAB+C處理組的pH值最低，在H2品種中最低可以達到4.27。這可能是因為在花生秧青貯飼料中引入了玉米芯等禾本科植物加工過程中剩余的副產(chǎn)物，降低了青貯飼料的緩沖能，雖然乳酸含量沒有明顯提高，但是pH值明顯降低。同時，玉米芯和稻殼粉等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物干物質含量較高，添加進花生秧青貯飼料當中能夠提高青貯飼料的干物質含量，本試驗當中青貯飼料中的干物質含量由30%左右提高到了33%左右，更加適合乳酸菌進行發(fā)酵[18]。這與杜昭昌等[10]的結果相似。

乳酸與乙酸的比值代表了青貯飼料中同型發(fā)酵和異型發(fā)酵的占比，比值越大同型發(fā)酵程度越高[17]。同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌組合形成的復合乳酸菌添加劑能夠有效提高青貯飼料的發(fā)酵品質，抑制真菌等有害微生物繁殖，提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性[19]，是目前商業(yè)青貯添加劑應用中的主要品種。本試驗所用乳酸菌LAB為復合乳酸菌，里面同時包含同型發(fā)酵和異型發(fā)酵乳酸菌。在本團隊之前的研究中該復合乳酸菌能夠顯著提高青貯飼料發(fā)酵品質[20]。在本研究中LAB處理組的乳酸和乙酸的比值低于CK組、乙酸含量高于CK組，證明布氏乳桿菌等異型發(fā)酵乳酸菌在花生秧青貯飼料中產(chǎn)生了效果。LAB+C和LAB+R處理組的乳酸和乙酸比值比LAB組高，乙酸含量比LAB組低，這可能是因為玉米芯和稻殼粉的添加增加了可溶性碳水化合物含量，提高了植物乳桿菌等同型發(fā)酵乳酸菌的發(fā)酵效率。該結果與Tian等[7]利用麥麩和玉米皮提高植物乳桿菌在苜蓿青貯飼料中發(fā)酵效果的研究相似。王思偉等[6]的研究表明，花生秧和全株玉米的混合青貯中隨著花生秧比例的增加pH值和乙酸含量顯著增加。在本研究中，添加稻殼粉和玉米芯顯著降低了青貯中的pH值和乙酸含量。花生秧青貯飼料4.6左右的pH值仍然較高，在花生秧等豆科植物中適當引入禾本科飼草及相應副產(chǎn)物有助于提高同型發(fā)酵乳酸菌的發(fā)酵效果，提高青貯品質。同樣的在秸稈當中加入適量的高蛋白飼料原料與乳酸菌添加劑能夠提升青貯飼料發(fā)酵品質[21]。本研究中品種和添加劑之間存在顯著的交互效應，且這種交互效應主要體現(xiàn)在發(fā)酵品質和乳酸菌數(shù)量上，這可能主要因為復合乳酸菌中植物乳桿菌等同型發(fā)酵乳酸菌和布氏乳桿菌等異型發(fā)酵乳酸菌的發(fā)酵效果受到了原料營養(yǎng)成分的影響。說明通過品種的選擇以及稻殼粉和玉米芯等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的應用，可以提高復合乳酸菌制劑中不同菌株的發(fā)酵效果。

氨態(tài)氮含量能夠表征青貯飼料中蛋白質的降解情況，主要由梭菌產(chǎn)生，氨態(tài)氮的含量越高，青貯品質越差[22]。當青貯飼料本身蛋白質含量較高時，添加適當比例的禾本科農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物能夠降低氨態(tài)氮含量。如姜俊芳等[23]研究表明，在稻殼添加量低于30%的時候，隨著稻殼添加量的增加高蛋白的筍殼青貯中氨態(tài)氮含量是下降的。但是對于蛋白質含量低一點的全混合日糧，隨著稻殼比例從0%到5%再到10%，氨態(tài)氮含量是增加的[24]。本試驗中添加稻殼粉和玉米芯及乳酸菌的復合添加劑能夠顯著降低青貯飼料中氨態(tài)氮含量，相對來說玉米芯的效果更好。原因在于添加劑及農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的添加提高了青貯飼料的發(fā)酵品質，抑制了蛋白質降解菌的繁殖，降低了氨態(tài)氮含量。同時玉米芯本身蛋白質含量較低，降低了青貯飼料的總氮含量，相對于其他添加劑相應的氨態(tài)氮產(chǎn)生量較低。

相比H1品種，H2品種蛋白質含量較低，纖維組分(中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質素)含量更高，受稻殼粉和玉米芯的影響小一些，但是添加稻殼粉和玉米芯及乳酸菌的復合添加劑后氨態(tài)氮含量降低幅度更大，pH值更低。目前尚未有針對花生秧不同品種青貯效果的比較研究，但是兩個品種發(fā)酵品質的差異多與蛋白質含量的高低有關。H1品種蛋白質含量較高，需要更多乳酸菌產(chǎn)生乳酸以提高發(fā)酵品質，而H2品種則更接近達到優(yōu)質青貯發(fā)酵效果。添加稻殼粉和玉米芯降低了花生秧青貯飼料的蛋白質含量，但在H1品種的青貯飼料中蛋白質含量仍超過10%。添加玉米芯及乳酸菌復合添加劑能夠有效降低花生秧青貯飼料的木質素含量，同時對于干物質體外消化率提升效果最好。這與Valadares等[25]利用玉米芯添加進甘薯藤(Dioscoreaesculenta(Lour.) Burkill)青貯中的效果相似。乳酸菌等對青貯飼料的體外消化率具有顯著的促進效果[26]，這與本研究的結果是相似的。同樣的體外消化率的變化主要是由于乳酸菌提高了青貯飼料的發(fā)酵品質，降低了非纖維營養(yǎng)成分的流失，從而提高了花生秧青貯飼料的體外消化率，而玉米芯的酸性洗滌木質素含量較低，對于提高體外干物質消化率也有一定作用。因為本研究所用復合添加劑包含3種乳酸菌及輔料，影響因素復雜，難以從理論上進一步進行分析及比較，后續(xù)將開展單一乳酸菌菌株與農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的復合添加研究，進一步分析提高青貯飼料體外干物質消化率的原因并提供進一步改進方案。

4 結論

乳酸菌、稻殼粉和玉米芯的使用能夠有效提高花生秧青貯飼料的發(fā)酵品質。粗蛋白含量更高的花生秧品種更需要添加復合添加劑以提高青貯發(fā)酵質量。在兩個品種當中，乳酸菌和玉米芯的組合使青貯具有最低的pH值和氨態(tài)氮含量以及最高的乳酸/乙酸比值，同時能夠降低青貯飼料的木質素含量，提高體外干物質消化率。綜上所述，乳酸菌和玉米芯的組合提高花生秧青貯飼料青貯品質的效果最好。