外泌體在卵巢癌中的研究進展

陳笑笑, 賀其志

(1. 同濟大學附屬第一婦嬰保健院婦科，上海 201204； 2. 同濟大學附屬第一婦嬰保健院病理科，上海 201204)

卵巢癌的死亡率居婦科惡性腫瘤之首[1]，其早期癥狀隱匿，缺乏有效的篩查和檢測手段，約75%的患者確診時已屬晚期。此外，由于卵巢癌易轉移且化療后易耐藥，晚期卵巢癌患者的5年生存率只有20%～30%[2]，對女性的生命健康造成嚴重的威脅。因此尋找靈敏度和特異度較高的卵巢癌早期診斷標志物，深入探討卵巢癌增殖、侵襲和轉移的機制，尋求有效抑制卵巢癌轉移的方法，對于降低卵巢癌的死亡率、提高5年生存率等均具有重要意義。外泌體是直徑為30～200 nm的細胞外囊泡，天然存在于各種體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等。腫瘤細胞分泌的外泌體攜帶原發腫瘤特異性的蛋白質和核酸，通過多種途徑促進腫瘤的增殖、轉移和侵襲[3]，因而受到了廣泛關注。在卵巢癌中，腫瘤來源的外泌體在卵巢癌的發生、發展及其生物學行為中都有著重要的作用。

1 外泌體簡介

外泌體的形成始于細胞內陷形成早期內體，早期內體進一步內陷形成多囊體(multivesicular bodies, MVBs)。最后，MVB與細胞膜融合向外界分泌的腔內囊泡(intrauminal vesicles, ILVs)稱為外泌體[4]。研究發現，MVBs主要是由運輸所需的內體分選復合體(endosomal sorting complex, ESCRT)介導形成的。ESCRT主要包含ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其主要功能是提供泛素化的蛋白質以誘導溶酶體降解。除此之外，其他蛋白也有助于外泌體的生物發生，包括凋亡誘導因子6相互作用蛋白(apoptosis-linked gene-2 interacting protein X, Alix),液泡分選蛋白4(vacuolar protein sorting 4, Vps4)，腫瘤易感基因101蛋白(tumor susceptibility gene 101, TSG101)和染色質修飾蛋白4(chromatin modifying protein 4, CHMP4)等[5]。目前，外泌體常見的生物標志物是四次穿膜蛋白(CD82、CD81、CD63和CD9)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)以及參與膜轉運與融合的相關蛋白(膜聯蛋白和Rab)[5]。外泌體的內部包含隨機吞噬的細胞質成分，富含mRNA、microRNA(miRNA/miRs),蛋白質和脂質。越來越多的研究表明，外泌體通過遞送多種生物分子介導信號轉導，在腫瘤的生長、轉移、血管生成及免疫調節和代謝方面發揮了重要的作用。Wang等[6]證明了在肺癌細胞中高表達的miRNA-141可通過外泌體途徑進入腫瘤基質血管內皮細胞，然后通過調節生長終止特異性同源盒基因(growth arrest-specific homeobox gene，GAX)的表達促進血管生成，從而促進腫瘤的侵襲。Chang等[7]發現通過調節miR-1228在外泌體中的表達，有望使其在胃癌的治療中發揮重要作用。Sun等[8]發現lncRNA-MALAT1通過抑制miR-503-5p的表達，介導Janus激酶2(janus kinase 2, JAK2)/信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信號通路的激活，促進卵巢癌細胞的增殖并抑制其凋亡。總之，外泌體在腫瘤的發生及進展中發揮著重要的作用，在腫瘤診斷和治療方面具有獨特的優勢和潛在的價值。

2 外泌體在卵巢癌轉移中的作用

外泌體在卵巢癌的發生、發展中扮演了重要的角色。卵巢癌細胞在生長過程中不斷將外泌體釋放到周圍環境，通過轉運特異性的核酸、蛋白質等，提高卵巢癌細胞的侵襲力，促進卵巢癌的轉移。眾多研究證實，外泌體與卵巢癌的關系密切，具體見表1。

表1 外泌體在卵巢癌轉移中的機制

2.1 外泌體促進卵巢癌細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)

腫瘤的發生、發展是一個極其復雜的過程，有多個調控和轉變在其中發揮作用。EMT是細胞的可塑性過程，伴隨著上皮表型的逐漸喪失和間充質表型的獲得，其在腫瘤發生發展過程中，為癌細胞提供了生長和轉移潛能[9]。

E-鈣黏蛋白表達的缺失是EMT的關鍵。研究表明，經過卵巢癌相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)衍生的外泌體處理過SKOV-3和CAOV-3細胞后，其間質標志物的表達升高，E-鈣黏蛋白的表達水平降低，促進EMT[10]。并且，CAF衍生的外泌體富含TGFβ1，可通過激活SMAD信號轉導進而調控癌細胞EMT[10]。Zong等[11]通過蛋白印跡法發現外泌體中的circ-WHSC1在卵巢癌組織中上調，誘導癌細胞發生EMT，從而加速了卵巢癌的腹膜擴散。除此之外，將從卵巢癌分泌的包含CD44的外泌體轉移到人腹膜間皮細胞(human peritoneal mesothelial cells, HPMC)，可以使HPMC重新編程為具有EMT的表型，從而促進卵巢癌的侵襲和轉移[12]。與良性腫瘤患者和健康者相比，卵巢癌患者的血清中miR-99a-5p水平顯著升高，并且纖連蛋白和波形蛋白的表達水平也顯著增加，進一步促進了上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)細胞發生EMT[13]。Cai等[14]還發現卵巢癌腹水中的外泌體通過傳遞miR-6780b-5p來增強卵巢癌細胞的EMT。卵巢癌的侵襲力不同，其分泌的外泌體對EMT的作用也有差異。與來自低侵襲能力細胞的外泌體相比，從高侵襲性卵巢癌細胞系中分離的外泌體在體內更能促進卵巢癌發生EMT和轉移[15]。總之，EMT在卵巢癌的增殖和轉移中發揮著至關重要的作用，而外泌體是調節EMT的上游信號物，進一步研究外泌體對EMT的調控作用將有助于揭示其在卵巢癌轉移中的作用機制。

2.2 外泌體促進卵巢癌的血管生成

血管生成是腫瘤生長和轉移的重要營養來源。外泌體通過改變血管內皮細胞的生物學特性和調節促血管生長因子來誘導血管生成，有利于腫瘤細胞的擴散和轉移[16]。

卵巢癌細胞分泌的外泌體含有轉錄因子2(activating transcription factor 2, ATF2)、轉移相關蛋白1(metastasis associated protein 1, MTA1)和CD147等，可誘導血管生成并增加血管通透性[16]，促進腫瘤的增生和轉移。其次，外泌體表面的可溶性上皮性鈣黏蛋白(sE-cadherin, sE-cad)也可以調控腫瘤血管生成。Tang等[16]證明了卵巢癌患者的腹水中高表達的sE-cad以外泌體的形式大量釋放，誘導血管生成。隨著腫瘤的生長，血液供氧不足，腫瘤組織內產生的乏氧環境促進其釋放外泌體，從而可刺激周圍血管形成。在乏氧條件下，卵巢癌細胞來源的外泌體中miR-130a的表達上調，促進血管內皮細胞增殖及血管形成[17]。隨著對以上研究的深入開展，將會有助于人們解析卵巢癌的血管生成分子機制，選擇新的靶點開展卵巢癌治療，以減少腫瘤的擴散。

3 外泌體影響卵巢癌的免疫微環境

外泌體在卵巢癌的腫瘤微環境中發揮了重要的作用，源自免疫細胞的外泌體可以靶向卵巢癌細胞發揮抗腫瘤作用，而卵巢癌細胞來源的外泌體通過多種途徑發揮免疫抑制和免疫逃逸的作用。卵巢癌細胞和免疫細胞之間通過外泌體相互作用，發揮抗腫瘤或促進腫瘤的作用，具體見表1。

卵巢癌衍生的外泌體抑制T細胞的活化。從腹水中發現大部分卵巢腫瘤細胞分泌的外泌體表面含有神經節苷脂GD3，其對唾液酸依賴性T細胞有抑制作用[18]，這種抑制作用在除去外泌體后，24～48 h內會逆轉，逆轉外泌體介導的T細胞下調的能力可能完全取決于細胞暴露于外泌體的持續時間[19]。在免疫抑制的各種機制中，攜帶精氨酸酶1(arginase-1, ARG1)的外泌體也是導致卵巢癌生長的重要因素。據報道，卵巢癌患者的腹水和血漿中含有攜帶ARG1的外泌體，其被運送至引流淋巴結，被樹突狀細胞吸收并抑制抗原特異性T細胞增殖[20]。此外，卵巢癌患者腹水中的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)陽性的外泌體可以阻斷T細胞中的NF-kB和NFAT信號通路，可逆地抑制T細胞活化[21]。

腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macro-phages, TAMs)是腫瘤微環境中最常見的免疫細胞之一，癌細胞與TAMs之間的通信影響卵巢癌的生長與轉移[22]。盡管在癌癥中炎性細胞產生大量的M1炎性介質，但TAMs的表型特征始終顯示其缺乏M1功能，主要表達M2功能。M2巨噬細胞可以釋放免疫抑制因子支持卵巢癌的免疫逃逸。在卵巢癌中，受到IL-4、IL-10、IL-13和IL-33刺激的巨噬細胞分化為M2型并分泌TGF-β、精氨酸酶-1和IL-6來增強血管形成、基質重塑和免疫抑制。TAMs衍生的外泌體中存在大量的miR-29a-3p和miR-21-5p,這兩種物質通過外泌體轉移到CD4+T細胞，抑制STAT3調節Treg和Th17的比例，幫助卵巢癌逃避主動免疫反應[23]。TAMs還通過STAT3信號級聯反應分泌TGF-β，SDF-1和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促進卵巢癌的轉移[24]。此外，M2型巨噬細胞通過外泌體轉移miR-221-3p靶向抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B(cyclin-dependent kinase inhibitor 1B, CDKN1B)，促進卵巢癌細胞的增殖[25]。在缺氧條件下，上皮性卵巢癌細胞分泌的外泌體含有豐富的miR-940，誘導巨噬細胞分化為M2表型[26]。源自卵巢癌干樣細胞的COX-2可以激活JAK和COX-2/PGE2途徑，以促進巨噬細胞的M2型極化[27]。總之，卵巢癌細胞可通過外泌體促進巨噬細胞分化成M2型，并且M2型巨噬細胞可以進一步分泌外泌體促進卵巢癌的生長和轉移，見圖1。

圖1 外泌體在卵巢癌免疫微環境中的作用Fig.1 Role of exosomes in the immune microen-vironment of ovarian cancer

4 外泌體在卵巢癌診斷方面的作用

由于卵巢癌的早期診斷率低、晚期死亡率高，已經開展了大量的研究以篩查疾病潛在的生物標志物。CA125是最早鑒定出的卵巢癌生物標志物。研究發現，卵巢癌治療成功時，循環系統中的CA125水平會降低，而水平升高則與耐藥和復發有關[28]。此外，CA125的表達也與其他疾病(例如肺癌和子宮內膜癌)有關，并受到其他因素(例如卵巢癌的進展和類型)的影響，缺乏診斷卵巢癌的特異性[28]。因此，以CA125為分子標志物得出的結果具有很高的假陽性和假陰性率，CA125不能作為診斷卵巢癌可靠的生物標志物[29]。除此之外，研究的另一種生物標志物人附睪蛋白4也像CA125一樣，不是可靠的生物標志物。這些生物標志物都具有較高的假陰性和假陽性率，必須進一步研究其他生物分子用于卵巢癌的早期檢測。

實際上，幾乎所有類型的細胞都釋放外泌體，可反映卵巢癌的病理變化，包括其生長、血管生成和轉移。由于缺乏早期檢測卵巢癌的方法，來源于卵巢癌細胞的外泌體被認為是有價值的生物標志物，主要存在于血液和腹水中，在早期診斷和預后具有巨大潛力。在一項研究中，觀察到miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-1290的水平在卵巢癌患者的腹水中升高，并且miR-200b水平與總生存率有關[30]。在另一項研究中，發現外泌體中miR-16，miR-21，miR-92a，miR-200b和miR-200c的表達水平與EOC患者的臨床病理和風險參數之間存在著顯著相關性，并且外泌體中miR-200b的定量具有診斷和預后的意義[31]。這些研究結果都表明了卵巢癌患者與健康者或是良性卵巢腫瘤患者相比，其外泌體中的miRNA表達水平發生了巨大的變化。因此，卵巢癌外泌體中的miRNA有望成為新的生物標志物。

外泌體中的蛋白質也已作為卵巢癌潛在的生物標志物得到大量研究。卵巢癌的外泌體中發現了CA125，其含量高于血液中游離的CA125[32]，顯著地提高了卵巢癌診斷的靈敏度。研究表明，從卵巢癌患者血漿中提取出的外泌體含有連接蛋白4，其表達與腫瘤分期呈正相關且靈敏度和特異度均較高[33]。此外，卵巢癌患者與非卵巢癌患者的外泌體相比，表達較高水平的TGFβ1[10]、EpCAM[34]、ADAM-10[35]等。總之，這些外泌體中的蛋白質具有成為卵巢癌生物標志物的潛力。

當然，除了外泌體中的miRNA和蛋白質可以作為卵巢癌潛在的分子標志物外，其他的外泌體相關分子也具有一定潛力。Lea等[36]發現，通過ELISA檢測方法可以檢測到卵巢癌患者的血液中含有PS的外泌體，根據外泌體中PS的含量可以鑒別卵巢癌和卵巢良性腫瘤。盡管外泌體作為卵巢癌的生物標志物具有很大潛力，但要實現其臨床應用仍然需要大量的研究。

5 外泌體在卵巢癌治療中的作用

藥物化療是治療卵巢癌并阻斷其惡性進展的重要方法，然而卵巢癌在化療后期極易產生耐藥，對治療效果產生巨大的影響。外泌體在卵巢癌化療耐藥的組織或細胞中表達下調或上升可發揮抑制卵巢癌化療耐藥性的作用，從而增強卵巢癌對化療的敏感性，起到對卵巢癌的治療作用。Zhao等[37]研究發現，circRNA CDR1as在順鉑耐藥卵巢癌患者的血清外泌體中下調，通過調控miR-1270/SCAI信號通路抑制耐藥卵巢癌細胞的增殖，促進順鉑誘導的耐藥卵巢癌細胞凋亡，增強了卵巢癌細胞的順鉑化學敏感性。研究發現，順鉑耐藥的上皮性卵巢癌患者的血漿外泌體circFoxp1上調，其作為致癌基因使上皮性卵巢癌對順鉑產生耐藥性，可作為上皮性卵巢癌潛在的治療靶點[38-39]。此外，源自抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)的外泌體[如B細胞和樹突狀細胞(dendritic cells, DC)]在通過免疫調節的抗腫瘤反應中也發揮重要的作用[40]。研究表明，來自DC的外泌體可以激活T細胞和NK細胞，并且DC細胞來源的外泌體可以影響晚期卵巢癌[40]。Besse等[41]使用DC細胞衍生的外泌體進行了針對晚期非小細胞肺癌的Ⅰ期臨床研究。22例卵巢癌患者接受了DC細胞衍生的富含IFN-γ的外泌體治療，其中7例病情穩定超過4個月，且這些患者的NK細胞功能增強。抑制血管生成也是卵巢癌既定的治療靶標，一些臨床試驗已經證實了VEGF靶向藥物在卵巢癌治療中的積極作用[42-43]。CD44在癌癥侵襲中也具有重要作用，其有望成為卵巢癌的治療靶標。但是，用CD44中和抗體進行全身治療的毒性水平太高[44]，需要開發出無毒替代療法，這表明免疫療法是外泌體應用于卵巢癌治療的選擇之一。Xu等[45]在一項臨床研究中發現miR-101可通過抑制神經源性營養因子抑制卵巢癌細胞的侵襲和遷移。而卵巢癌外泌體中miR-101的表達降低可增強卵巢癌細胞的遷移。因此，miR-101也可能是卵巢癌的潛在治療藥物。盡管外泌體在卵巢癌治療上具有很大前景，但外泌體的大規模生產、尋找細胞來源及其對靶細胞的特異性方面仍然面臨許多挑戰。

6 展 望

外泌體在卵巢癌的進展中起著至關重要的作用。卵巢癌細胞釋放外泌體作用于體內免疫細胞、間質細胞、實質細胞等，而這些細胞又分泌外泌體反過來作用于卵巢癌細胞，它們以外泌體作為細胞間通信介質相互影響，形成特殊的微環境。因此，闡明卵巢癌與外泌體之間的關系對于理解腫瘤形成的機制非常關鍵。此外，卵巢癌中的外泌體包含多種生物信息分子，以一種物質作為生物標志物，其靈敏度和特異度大都不盡如人意，或許將多個分子作為生物標志物會取得更好的效果。最后，利用外泌體治療卵巢癌也具有巨大潛力。外泌體具有穩定性和特異性，可以作為藥物傳遞的載體，用于分子生物療法和抗腫瘤免疫療法。但是，將外泌體用于卵巢癌的治療還存在著許多挑戰，例如目標外泌體的選擇、目標外泌體的分離和純化、工程化外泌體的作用效果等。外泌體在腫瘤生物學中的重要性以及各種研究結果都表明外泌體在腫瘤診療中的重要作用，應對其開展進一步探索，為其臨床應用奠定理論基礎。