子宮內膜異位癥大鼠在位及異位內膜組織中RAS與MEK的表達

王芳，王麗春，商麗紅，陳華，李詠梅，哈春芳，5

1.寧夏醫科大學臨床學院，寧夏 銀川 750004；

2.寧夏回族自治區人民醫院婦產科，寧夏 銀川 750004；

3.寧夏銀川市婦幼保健院，寧夏 銀川 750004；

4.寧夏醫科大學總醫院婦科，寧夏 銀川 750004；

5.寧夏醫科大學生育力保持重點實驗室，寧夏 銀川 750004

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是指伴隨經血逆流的子宮內膜在宮腔外異質性生長形成的一種全身性慢性炎癥性疾病，與慢性盆腔疼痛、不孕和月經紊亂有關。研究顯示，大約10%的育齡期女性患有子宮內膜異位癥，其中合并不孕癥者約50%，嚴重影響患者的心理和社會福祉[1-2]。盡管付出了巨大努力，但子宮內膜異位癥的病理生理學仍是生殖醫學中的一個未解之謎。新近研究表明，該疾病的發展是多因素的，涉及激素、免疫、環境和遺傳因素[3-4]。此外有研究報道，逆行子宮內膜細胞增殖、黏附和侵襲性增加所引起的生物表型變化促進了內異癥的發展，因此，需要深入探索相關基因在EMs 中的致病機制并在此策略基礎上開發新的藥物治療。

研究表明，原癌基因RAS蛋白作為絲蘇氨酸蛋白激酶(MAPK)/ERK 途徑的上游通路分子在促進惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等生物學功能中起著分子開關的作用，但其在內異癥中的具體作用機制未有報道[5]。MAPK 是絲氨酸-蘇氨酸激酶，在細胞增殖、細胞黏附、血管生成、侵襲和轉移中發揮重要作用。內異癥相關研究顯示：MAPK通路似乎在子宮內膜異位癥細胞內和細胞外信號轉導中起著關鍵作用。與健康女性相比，子宮內膜異位癥患者在位內膜細胞增殖和存活的增強與MAPK 信號通路的異常激活有關[6]。本課題組前期通過表達譜芯片測序分析了子宮內膜異位癥中差異基因表達，發現RAS、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)等因子顯著上調，但兩者在EMs中的表達及其作用機制尚不清楚。因此本研究建立子宮內膜異位癥大鼠模型，旨在探討EMs大鼠在位及異位內膜組織中RAS與MEK的表達水平及其與子宮內膜異位癥發生發展的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雌性未孕大鼠20只，鼠齡6～8 周，體質量(200±20)g，購買并飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心。模型組大鼠及對照組大鼠各10 只，各組間鼠齡和重量差異無統計學意義，該實驗經由寧夏醫科大學動物實驗中心倫理委員會批準。

1.1.2 實驗材料 兔多克隆抗體RAS(ab52939)和兔多克隆抗體MEK(ab178876)購自英國Abcam 公司。SYBR?Premix Ex Taq(RR820A)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)均購自日本TaKaRa 公司，BCA 蛋白提取試劑盒和蛋白檢測試劑盒購自凱基公司。免疫組化檢測試劑盒和DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型 建立大鼠清潔級環境飼養1周，手術前2 d 以戊酸雌二醇0.5 mg/kg 灌胃統一動情周期。自體移植法建模[7]：大鼠稱重后1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。腹部備皮，常規消毒后于尿道口上方1 cm處切開長約2 cm 的縱行切口，逐層進腹，找到雙角子宮，分離并剪下約1.5 cm 長的左側子宮放入生理鹽水中，沖洗干凈后分離子宮內膜組織，并將其剪成5 mm×5 mm 大小四塊，內膜面貼腹壁用6～0 可吸收線四角縫合固定于兩側腹壁血運豐富處，逐層關腹，待大鼠自然蘇醒，其中對照組大鼠只開關腹不行內膜移植。術后肌注青霉素(1.6×105U/kg)連續3 d。術后4 周開腹觀察移植物外觀。造模成功標準：移植物體積增大，形成內含淡黃色清亮或者咖啡色液體的囊狀結構，表面及周圍或可見血管形成。

1.2.2 組織病理學染色(HE) 取EMs 模型組大鼠在位、異位內膜組織及對照組大鼠在位內膜組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，常規石蠟包埋切片(厚度5 μm)、切片經脫蠟至水，蘇木素染核、分化液分化、返藍液返藍、伊紅染色、梯度酒精脫水及二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫組織化學染色(IHC) 烤片后，組織切片經脫蠟、復水、微波抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，一抗MEK(1：500)、RAS(1：200)4℃冰箱孵育過夜，次日切片復溫，兔二抗孵育，DAB 顯色，蘇木素染核，梯度酒精脫水，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察各蛋白因子表達定位情況。

1.2.4 Western blot蛋白檢測 取大鼠在位及異位內膜組織提取總蛋白，按照BCA蛋白檢測試劑盒使用說明測定蛋白濃度。每個加樣孔上樣20 μg 蛋白，經電泳、PVDF膜轉膜，室溫封閉，一抗MEK(1∶20 000)、RAS(1∶5 000)、β-actin(1∶5 000)4℃孵育過夜。次日室溫孵育，加抗兔二抗(1∶10 000)。加適量ECL增強液在BIO-RAD成像儀中進行發光，采用Image J軟件對目的條帶進行分析，根據曝光結果計算蛋白相對表達量。

1.2.5 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR檢測RAS 及MEK mRNA 表達：提取組織中的總RNA，使用微量分光光度計檢測RNA 濃度和純度，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄PCR反應，融解曲線判斷PCR反應的特異性，以GAPDH為內參，所得各樣品Ct值利用公式計算各樣品mRNA的相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統計學方法 所得數據均使用GraphPad Prism 7 統計學軟件分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩樣本間比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA 分析，Pearson 相關分析法分析兩者相關性。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EMs大鼠模型建立及異位病灶肉眼觀表現 自體移植法建模及異位病灶肉眼觀表現：移植物體積增大，形成內含清亮或者咖啡色液體的囊狀結構，表面或周圍可見新生血管及黏連形成，見圖1。

圖1 EMs大鼠模型異位病灶外觀表現

2.2 EMs大鼠在位及異位的內膜形態 HE染色可見：與對照組大鼠相比，異位病灶組織見子宮內膜腺上皮細胞或者腺體生長，即為模型建立成功，見圖2。

圖2 EMs大鼠在位及異位內膜形態（HE染色，×200）

2.3 EMs大鼠內膜組織中RAS及MEK的表達定位 免疫組化結果顯示：RAS 蛋白主要定位于子宮內膜腺體及腺上皮細胞的胞漿中，間質及胞核內少量表達。MEK主要定位于子宮內膜腺體的胞漿中，胞核內少量表達，見圖3和圖4。

圖3 各組中RAS蛋白的表達（免疫組化染色，×400）

圖4 各組MEK蛋白的表達（免疫組化染色，×400）

2.4 EMs大鼠內膜組織中RAS及MEK的表達比較 Western blot 結果顯示：與對照組相比，EMs 大鼠在位及異位內膜組中RAS及MEK蛋白相對表達水平增高，且EMs 異位內膜組表達高于EMs 在位內膜組(FRAS=235.32，P＜0.001；FMEK=272.37，P＜0.001)，見圖5和表2。

表2 RAS及MEK蛋白在三組內膜中表達水平比較（±s）

表2 RAS及MEK蛋白在三組內膜中表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與在位內膜組比較，bP＜0.01。

組別對照組EMs在位內膜組EMs異位內膜組F值P值MEK 0.50±0.05 0.94±0.08a 1.24±0.08b 272.37＜0.01例數10 10 10 RAS 0.32±0.10 0.86±0.08a 1.15±0.11b 235.32＜0.01

圖5 Western blot 檢測EMs 大鼠在位/異位內膜中RAS及MEK 蛋白表達

2.5 EMs 大鼠內膜組織中RAS 及MEK mRNA的表達比較 qRT-PCR 結果顯示：與對照組比較，EMs大鼠在位及異位內膜組中RAS及MEK mRNA表達水平增高，且EMs異位內膜組表達高于EMs在位內膜組(FRAS=248.72，P＜0.001；FMEK=100.28，P＜0.001)，見表3。

表3 RAS及MEK mRNA在三組內膜中表達水平比較（±s）

表3 RAS及MEK mRNA在三組內膜中表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與在位內膜組比較，bP＜0.01。

組別對照組EMs在位內膜組EMs異位內膜組F值P值MEK 0.53±0.16 0.94±0.08a 1.24±0.08b 100.28＜0.01例數10 10 10 RAS 0.32±0.09 0.79±0.08a 1.08±0.06b 248.72＜0.01

2.6 EMs 大鼠在位/異位內膜組織RAS 與MEK蛋白表達水平的相關性 Pearson 相關分析結果顯示：EMs 在位內膜組和EMs 異位內膜組中，RAS 蛋白與MEK 蛋白表達水平均呈正相關(r異位內膜組=0.68，P=0.032 3；r在位內膜組=0.79，P=0.006 9)，見圖6。

圖6 EMs大鼠在位/異位內膜中RAS與MEK的相關性

3 討論

子宮內膜異位癥作為一種常見的慢性炎癥性激素依賴性疾病，影響全球數百萬女性的健康和生活方式。迄今為止，子宮內膜異位癥發生發展的確切病理生理學機制尚未確定，但證據表明，包括卵巢類固醇激素失衡、炎癥、增殖侵襲表型功能轉化在內的多種因素在子宮內膜異位癥的發病機制中起著關鍵作用[8-9]。目前治療方式上仍以手術結合藥物治療為主，但激素類藥物的不良反應和手術后高復發率使得EMs的治療仍面臨巨大的挑戰[10]。因此，探索EMs潛在發病機制及新的臨床治療靶點顯得尤為重要。本實驗采用自體移植法誘導建立EMs大鼠模型，旨在探討RAS與MEK表達及其在內異癥的發生中的相關性。

RAS蛋白激酶屬于小GTP膜結合蛋白，被錨定在質膜的內表面，作為有活性的RAS-GTP 和無活性的RAS-GDP 有序循環的二元開關激酶在細胞信號轉導過程中發揮作用[11-12]。研究報道，RAS 蛋白家族成員與主要下游信號通路如RAF/MAPK、PI3K/AKT 和細胞因子激活有關，從而在癌癥和腫瘤中驅動異常信號，促進惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移，是腫瘤治療的靶點之一[13-14]。已有研究表明，異位內膜細胞增殖侵襲性增強與EMs的發病存在明顯的相關性[15]，但EMs 患者異位內膜增殖侵襲性增強是否與RAS 蛋白激酶及其下游激酶活化相關尚不清楚。課題組前期表達譜芯片測序分析了子宮內膜異位癥中差異基因表達：發現RAS、MEK蛋白表達水平顯著上調，但兩者在EMs 中的表達及其作用機制尚不清楚。本研究建立EMs 大鼠模型，免疫組化結果顯示，RAS 蛋白在EMs在位及異位內膜的腺體、間質及腺上皮細胞中均有表達。Western-blot及qRT-PCR檢測結果均顯示：與對照組相比，EMs 在位及異位內膜組中RAS 蛋白及mRNA的表達量均增高，異位內膜組的表達水平高于在位內膜組(P＜0.05)，揭示RAS 蛋白激酶表達升高可能與EMs的發病存在一定的相關性，但其具體作用機制還需進一步研究。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)是絲氨酸-蘇氨酸激酶，在細胞增殖、細胞黏附、血管生成、侵襲和轉移中發揮重要作用。MEK是MAPK家族成員之一，活化后調控與腫瘤的發生發展密切相關的細胞增殖分化、細胞遷移、侵襲等多種生物學效應[16-17]。子宮內膜異位癥為子宮內膜異位病變的生存提供了獨特的微環境，包括細胞增殖、分化、遷移和凋亡。而對于這些細胞活動，細胞內激酶的級聯激活是必需的。越來越多的證據表明，子宮內膜異位癥作為一個多因素調控的復雜的激素依賴性炎性疾病，MAPK激酶級聯的異常活化在EMs發病關系中發揮了始動作用，但其具體作用機制仍然不清[18-21]。本研究免疫組化結果顯示：MEK蛋白主要表達于子宮內膜腺體及腺上皮細胞的胞漿中。Western-blot及qRT-PCR檢測EMs在位及異位內膜組中MEK蛋白及mRNA表達均顯著增高(P＜0.05)，說明EMs中MEK蛋白處于過度活化狀態，其可能與子宮內膜異位癥的發生密切相關。腫瘤研究表明，活化的RAS募集級聯反應并激活MAPK級聯反應中的MEK1/2，使其完全激活進而活化各種下游應答分子，參與調控細胞增殖、侵襲、存活等多種細胞功能[22-23]。本實驗從蛋白及基因水平證實RAS與MEK蛋白在EMs大鼠在位及異位內膜組織中高表達，進一步分析二者在EMs大鼠在位及異位內膜組織中表達均呈正相關，提示二者表達相輔相成，可能與子宮內膜異位癥的發生密切相關，但其具體的調控機制有待于后續進一步研究。

綜上所述，本實驗結果證實RAS 與MEK 蛋白在EMs大鼠內膜組織中表達增高且呈正相關，推測子宮內膜異位癥的發生可能與兩者相互協同作用相關。后續本課題擬進一步通過臨床組織水平及細胞水平驗證RAS蛋白活化MEK表達影響EMs間質細胞增殖侵襲性的具體調控機制，為內異癥的潛在治療靶點提供系統深入的研究。