CircRNAs在阿爾茲海默病中的研究進展

劉文勝 綜述 柳湘潔審校

華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院老年病科，湖北 武漢 430077

阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)是一種與衰老相關的最常見的神經退行性疾病，目前全世界范圍內有超過4 000萬人患此病[1-2]，其已成為一個重大的公共衛生問題，給個人、社會和經濟造成沉重負擔[3]。1907 年，德國精神科醫生和神經病理學家ALOIS ALZHEIMER博士首次描述了阿爾茲海默病[4]。根據2015年世界衛生組織(WHO)的研究，阿爾茲海默病占老年癡呆癥病例的60%～70%，到2050 年其發病率估計增加兩倍[5-6]。目前普遍認為，淀粉樣前體蛋白(APP)裂解的變化、APP片段和β-淀粉樣蛋白(Aβ)的產生和沉積是導致阿爾茲海默病的可能原因，被稱為淀粉樣蛋白級聯假說[4]。Aβ是阿爾茲海默病最主要的病理學特征和診斷指標，可以用來與其他伴有癡呆癥狀的神經退行性疾病區分[7]。此外，tau磷酸化學說、膽堿能學說、胰島素假說、氧化應激學說等也被認為是阿爾茲海默病可能的致病機制[8-9]。盡管患有AD的患者人數在不斷增長，但在美國目前僅批準了五種方案來治療AD的認知癥狀，其中最近的一項(美金剛)已于十多年前獲得批準[10]。這些藥物包括三種膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊，加蘭他敏和卡巴拉汀)和一種N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑(美金剛)[11]。在過去的15年中，很多科研機構在研發治療AD的藥物，但大多數都失敗了。目前，大多數已被確診為AD的患者僅以被動接受藥物治療為主，且治療效果不佳。因此，尋找新型可延緩或逆轉AD的藥物仍是目前的重中之重。

circRNAs 是一類內源性的環狀非編碼RNA 分子。CircRNAs 以前被認為是轉錄后加工過程中錯誤剪接事件衍生的產物，并且豐度低，功能潛力小[12]。但是，最近有越來越多的證據表明，circRNAs 在整個真核細胞中分布廣泛，種類繁多，它們具有多種生物學功能，并且在各種疾病(例如神經退行性疾病和癌癥)中發揮著潛在的重要作用[13-15]。CircRNAs已在許多生物學領域得到廣泛認可和重視。先進的研究表明，大腦中有成千上萬的circRNAs[16-17]。隨著深度測序技術的發展，臨床已經鑒定出其他新穎的circRNAs，并顯示與腦部疾病有關。最近的研究表明，circRNAs 在神經退行性疾病中可能起重要作用，包括阿爾茲海默病[18-20]。本篇綜述將討論circRNA的分類和功能以及circRNAs在阿爾茲海默病中的研究進展。

1 circRNA的分類

大多數circRNAs 是通過反向剪接由前體mRNA(pre-mRNA)形成的。隨著測序技術的發展，已經發現并鑒定了幾種類型的circRNAs。根據其特征可以分為四個亞型，即外顯子型circRNAs(ecircRNA)、環狀內含子型circRNAs (ciRNA)、外顯子-內含子型circRNAs(EIciRNA)和tRNA內含子型circRNA(tricRNA)。

1.1 EcircRNA EcircRNA主要位于細胞質中，主要來源于單個或多個外顯子，通過轉錄產物的反向拼接形成的。5'剪接位點(剪接供體位點)與3'剪接位點(剪接受體位點)相連，產生包含外顯子和內含子的套索結構[21]。套索狀結構中的內含子被去除后外顯子通過和磷酸二酯鍵連接形成ecircRNA 分子[22]。另外，內含子中的Alu重復序列可以彼此相互作用，以促進反向剪接[27]。

1.2 CiRNA 在形成CiRNA 的過程中，內含子從前mRNA分子中切除，并通過兩個末端之間的獨特2'-5'連接進行進一步連接，然后修剪尾部形成CiRNA。CiRNA 主要存在于細胞核中，僅包含內含子。其加工取決于共有基序，這些基序包含靠近5'剪接位點的富含7-nt GU 的元素和靠近分支點位點的富含11-nt C的元素[23]。

1.3 EIciRNA 與EcircRNA(僅包含外顯子)不同，EIciRNA 既包含外顯子又包含內含子。一個外顯子的5'下游位點(剪接供體位點)通過5'-3'磷酸二酯鍵連接到另一個外顯子的3'上游位點(剪接受體位點)，并受套索驅動的環化作用。在反向剪接過程中，內含子被保留在外顯子之間[24-25]。

1.4 TricRNA TricRNA 通 過pre-tRNA 剪 接 形成。通過tRNA 剪接酶將內含子從前tRNA 分子中去除。隨后，在內含子的末端形成具有3'-5'磷酸二酯鍵的閉環結構，產生tricRNA[26]。

2 CircRNAs的功能

2.1 CircRNAs調節線性RNA的轉錄 CircRNAs可以影響線性RNA的剪接，并在選擇性剪接和轉錄中發揮關鍵作用。外顯子是CircRNAs 的主要來源，而CircRNAs 的合成過程與線性RNA 的典型剪接競爭，因為外顯子對于通過典型剪接形成的線性mRNA 也是必不可少的[27]。因此，當CircRNA和線性mRNA的形成都需要相同的外顯子時，這兩個過程將相互競爭。CircRNAs 還可以與細胞質中的RNA 結合蛋白(RBPs)或與RNA 相關的蛋白相互作用，形成RNA-蛋白復合物，影響基因轉錄或蛋白質翻譯。CircRNA-RBP 復合體可以調控靶基因的轉錄和剪接，改變線性mRNA的剪接模式和mRNA穩定性，并啟動其翻譯。此外，CircRNAs 可以與RBPs 相互作用以募集miRNA，從而影響下游靶mRNA的翻譯[27]。由內含子形成的CircRNAs，例如CiRNA 和EIciRNA，可以調節其親本基因的表達。在細胞核中，發現CircRNAs 通過與U1小核核糖核蛋白(U1 snRNP)和RNA聚合酶Ⅱ相互作用來調節轉錄[28-29]。EIciRNA 與U1 snRNPs 相互作用形成EIciRNA-U1 snRNPs復合物，并在其親本基因啟動子處與RNA聚合酶Ⅱ相互作用，以增強這些基因的表達[30]。

2.2 CircRNAs充當miRNA的“海綿” CircRNAs可以作為miRNA 的海綿，抑制miRNA 介導的mRNA表達[31]。作為競爭性內源RNA，CircRNAs 可通過與miRNA 反應元件結合而與miRNAs 競爭。CircRNAs包含一個或多個miRNA 結合位點，從而減少了miRNA介導的基因抑制表達，進而調控下游靶基因表達。

2.3 CircRNAs充當蛋白質翻譯的模板 大多數CircRNAs 都是由編碼片段產生的。因此，一些CircRNAs 可能具有編碼蛋白質的潛力。5'7-甲基鳥苷帽結構和3'poly(A)尾部是正常的線性mRNA 翻譯所必需的。然而，由于circRNAs 既缺少帽蓋又沒有poly(A)尾巴，因此它們似乎沒有合適的結構來支持翻譯起始。最近的研究表明，CircRNAs 也可以翻譯成蛋白質或肽。為了將CircRNA翻譯成為功能性蛋白，它必須包含一個開放閱讀框和一個內部核糖體進入位點(IRES)。IRES是內源性CircRNAs 中的特殊核苷酸序列，可獨立于5'帽結構啟動蛋白質翻譯[32]。一旦在其IRES處啟動翻譯，CircRNA就會充當蛋白質翻譯的模板。

2.4 CircRNAs與蛋白質相互作用 CircRNAs可以與不同的蛋白質相互作用形成特定的CircRNA-蛋白質復合物(circRNPs)，隨后會影響相關蛋白質的作用方式。例如，circMbl可與甘露糖結合凝集素(MBL)相互作用，并充當MBL 和circMbl 產生的負反饋調節劑[27,33]。MBL和circMbl由相同的基因位點產生，并且在它們的產生之間存在負調節反饋。當以過量濃度存在時，MBL結合至MBL pre-mRNA并導致其反向剪接形成circMbl。然而，當MBL蛋白與circMbl結合而濃度降低時，沒有足夠的MBL 與circMbl 相互作用。此時，CircMbl的產生就會減少。

3 CircRNAs在AD中的作用

長期以來，AD患者大腦中β淀粉樣蛋白(Aβ)的過度積累一直被認為是AD病理的最重要原因之一[34-35]。AD患者大腦中Aβ的異常水平導致斑塊的形成，并進一步導致由小膠質細胞激活介導的神經元炎癥反應，從而促進AD進展[36]。此外，越來越多的證據表明，氧化應激和功能障礙的自噬在Aβ的產生中起著至關重要的作用，并可能加速AD 的發展[37-38]。目前研究發現，一些CircRNAs 在神經炎癥、氧化應激和自噬以及Aβ的產生和降解中發揮重要的調節作用。

3.1 CircRNAs與神經炎癥 神經炎癥通常被認為是由損傷或淀粉樣斑塊形成引起的神經膠質活化的結果，進一步導致腦功能惡化，這與AD 風險增加有關[39]。CircRNAs 已被報道參與神經炎癥的調節。研究已證實，CircRNA_0000950在AD的細胞凋亡、神經突生長和神經炎癥中起重要作用。此外，YANG等[40]證明cir cRNA_0000950 充當miR-103 海綿來減少miR-103 的表達，進一步提高細胞AD 模型中前列腺素氧化環化酶2 的水平。盡管circRNA_0000950的表達不受神經元細胞中Aβ1-42誘導的影響，但是circRNA_0000950 的過表達促進神經元細胞凋亡，抑制神經突生長并提高炎性細胞因子水平，而circRNA_0000950 的敲除后出現相反作用。因此circRNA_0000950的敲除是治療AD的一種潛在治療手段。

3.2 CircRNAs與氧化應激 氧化應激已被認為是導致衰老和AD進展的一個重要因素[38]。活性氧的增加會促進Aβ蛋白前體的表達和加工，導致Aβ積累并激活大腦中各種信號通路，從而進一步促進AD 的發 展[41]。HUANG 等[42]研 究 表 明，mmu_circRNA_013636 和mmu_circRNA_012180 表達的調節與AD氧化應激損傷的預防有關。他們發現SAMP8(快速老化動物模型)小鼠海馬組織中mmu_circRNA_013636 增加，mmu_circRNA_012180 減少；然而，三七總皂苷(PNS)的治療逆轉了AD小鼠大腦中這些CircRNAs的表達變化。進一步的功能分析表明，mmu_circRNA_013636 和mmu_circRNA_012180 參與代謝、神經營養因子和糖酵解以及磷脂酰肌醇信號通路，這些已被證明有助于AD 的發病機理。上述結果表明，mmu_circRNA_013636 和mmu_circRNA_012180 表 達的調節可能通過抗氧化應激機制參與PNS對AD的治療作用，這表明這些CircRNAs是AD治療藥物開發的潛在靶標。

3.3 CircRNAs與自噬 自噬是長壽蛋白質和細胞器的主要細胞降解途徑。自噬體的積累是AD 的早期神經病理學特征，直接影響Aβ代謝。研究表明，特定CircRNAs 的表達與AD 中的自噬密切相關。例如，最近有報道稱CircNF1-419 與AD 中的自噬密切相關[43]。老年SAMP8 (快速老化動物模型)小鼠中CircNF1-441的過表達會增強自噬，進一步降低tau 蛋白、p-tau 蛋白、Aβ1-42蛋白和載脂蛋白E(APOE)的水平，并影響與衰老相關的調節子p21、p35/25 和p16 的表達。 此外，CHEN 等[43]證實circNF1-419 通過與動力蛋白-1 (Dynamin-1)和銜接蛋白2B1(AP2B1)相互作用來調節自噬。CircNF1-441 結合Dynamin-1 和AP2B1影響它們的mRNA剪切、穩定和翻譯。這些結果表明，circNF1-419 可通過與Dynamin-1 和AP2B1相互作用增強自噬，從而延遲AD 的發展。其他研究表明，CircRNAs可能與自噬小體組裝或囊泡運輸介導的途徑有關。HUANG 等[44]的研究發現10 個月大的SAMP8 (快速老化動物模型)小鼠的mmu_circRNA_017963 水平與對照組小鼠相比明顯降低，表明該CircRNA 與AD 發病機理有關。進一步的分析表明，mmu_circRNA_ 017963 可 能與mmu_miR_7033-3p 結合，并且它可能參與自噬小體組裝、胞吐作用和突觸小泡循環的生物學過程，這些已被證明與AD 的發病機理有關。

3.4 CircRNAs與Aβ產生 AD病理學的一個主要特征是由聚集的淀粉樣蛋白Aβ組成的斑塊的形成。減少Aβ的產生一直是近年來AD 實驗研究的主要目標[34-45]。一些CircRNAs 已被鑒定出直接或間接參與Aβ生成的調節，表明它們在AD病理中起著重要的作用。例如，miR-7的circRNA海綿(ciRS-7)以前被認為是miR-7 的內源性海綿，最近有報道稱它在AD 的發病機制中起著至關重要的作用。先前的研究表明，ciRS-7 在人腦中富集，但在AD 患者的腦中表達下調。ZHAO等[46]發現，ciRS-7改變了泛素蛋白連接酶A(UBE2A)的表達，這對于清除AD 中的Aβ是至關重要。在散發性AD 中，ciRS-7 下調并且miR-7 的水平升高，導致UBE2A 表達降低[39]。UBE2A 在泛素26S蛋白酶體系統中起著中央效應器的作用，通過蛋白水解促進Aβ的清除。然而，在散發性AD 腦中，UBE2A已耗盡，這進一步誘導了淀粉樣蛋白Aβ的積累和老年斑的沉積。最近，SHI等[47]研究表明，ciRS-7在調節β-分泌酶(BACE1)和APP蛋白水平中也起著至關重要的作用。其中，BACE1 已被確定為AD病理生理學中產生Aβ肽的關鍵酶。BACE1 對APP 的裂解誘導Aβ肽釋放并引發Aβ斑塊形成[48]。SHI 等[47]發現ciRS-7 不影響APP 和BACE1 的mRNA 水平，而是降低APP 和BACE1的蛋白水平。他們的進一步研究表明，在人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y中ciRS-7 過表達會上調泛素羧基末端水解酶L1 (UCHL1)的mRNA 和蛋白水平，從而通過蛋白酶體和溶酶體途徑，加速APP 和BACE1 的降解，并減少Aβ的產生[47]。因此，表明ciRS-7具有潛在的神經保護作用。

LU 等[49]研究發現，circRNA HDAC9 也與Aβ生成的調節有關。CircHDAC9 在輕度認知障礙(MCI)和AD 患者的血清中顯著低于其他正常的個體，并且在AD 的小鼠和細胞模型中也降低。此外，研究表明cir cHDAC9充當miR-138海綿，可顯著降低miR-138的水平，同時增加沉默信息調節因子1(sirtuin1，Sirt1)的蛋白表達。先前有研究已經證實，Sirt1在減少Aβ的積累和減輕線粒體功能障礙方面發揮著重要的作用[50]。LU 等[49]發現，在體外實驗中CircHDAC9表達可以減少過量Aβ肽的產生，這表明cir cHDAC9可能是AD的治療靶標。

ZHANG 等[46]研究表明，circRNA KIAA1586 可以作為競爭性內源RNA 發揮功能，吸附miR-29b、miR-101 和miR-15a，這可能與AD 的病理過程有關。 PEREIRA 等[51]研究表明，在AD 細胞模型中，miR-29b 的過表達抑制了BACE1 的mRNA 和蛋白表達，并降低了Aβ42的水平。LONG等[52]證實了miR-101可以與APP的3'-UTR結合以降低AD中APP的水平。HEBERT 等[53]發現散發性AD 患者的表達miR-15a 的大腦皮質發生了顯著變化，并預測miR-15a 可以結合并調節BACE1 和APP。這些結果表明，circRNA KIAA1586是治療AD潛在的靶標。

4 結語

CircRNAs具有高度穩定性，能夠穩定地存在于血漿和腦脊液中，因此具有診斷神經系統疾病的巨大潛力。最近的一項研究表明，CircRNAs 表達水平與AD的神經病理學和臨床嚴重評估密切相關[18]。DUBE等[18]實驗已經表明，CircRNAs 的表達在AD患者實質性癥狀發作之前已經發生了改變，并且它們在血漿中穩定存在和在外泌體中富集。這一發現表明，CircRNAs 可以作為癥狀前和癥狀性AD 以及潛在的其他神經退行性疾病的外周生物標志物。

CircRNA與特定的miRNA共享結合位點，這使它們能夠充當miRNA海綿并抑制這些miRNA的調節功能。同時，CircRNAs 在Aβ的產生和代謝、氧化應激、自噬和神經炎性途徑中起重要作用。此外，一些CircRNA可用作具有AD診斷潛在價值的新型生物標志物，如CircRNA_0000950 、mmu_circRNA_013636、mmu_circRNA_012180、CircNF1-419 和ciRS-7等。

如上所述，CircRNAs 在AD 中起關鍵作用，并且可能具有治療AD 的潛力。更多的CircRNAs 的表達特征和功能應在未來的研究中得以探究，以開發AD的新型治療靶標和生物標志物。