miR-3934-5p在老年胃癌病人中的表達及臨床意義

孫潔 查秀芳 張楠楠 桑楠 趙君寧 何偉‰

胃癌(GC)是全世界第五大常見的癌癥，并且是與癌癥相關的第三大死亡原因。大多數GC病人有鄰近器官或遠處轉移，這是GC病人死亡的主要原因[1]。因此對GC病人組織表達的變化進行深入研究，發現早期GC病人潛在的生物標志物和用于治療的新型靶標對改善病人預后至關重要。

miRNA是內源性微小RNA，通過作用于靶基因從而在許多生物學功能中起關鍵作用[2]。目前尚無關于miR-3934-5p在GC病人中的表達及其潛在作用機制的研究。本研究通過利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫對GC病人的臨床特征和生存預后進行生物信息學分析，評估miR-3934-5p的表達在老年GC病人中的預后意義以及與臨床特征之間的關聯，并通過生物信息學分析預測miR-3934-5p的靶基因及其潛在作用，探討miR-3934-5p在GC發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 數據來源及分析工具 從TCGA 數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/) GC(STAD)項目中獲得level 3 BCGSC miRNA Profiling的miRNAseq數據和臨床數據。使用非配對樣本散點圖及配對樣本的散點連線圖評估GC病人中miR-3934-5p的表達水平。使用R軟件(3.6.3版)中的limma包分析GC組織和匹配的正常組織之間表達水平的差異，pROC包進行ROC分析，survminer包、survival包進行生存資料的統計分析，ggplot2包用于數據可視化[3]。由于數據是從TCGA數據庫中獲得的，因此無需倫理委員會批準。UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)是一個挖掘TCGA數據庫的在線分析網站[4]，在網站主頁輸入miR-3934-5p，獲得其在GC組織和正常胃黏膜組織中的表達情況，并從年齡、腫瘤分期、腫瘤分級、淋巴結轉移、TP53突變等不同亞組分析miR-3934-5p的表達差異。

1.2 miR-3934-5p靶基因預測及功能富集分析 使用在線分析工具miRDB(http://www.mirdb.org)[5]、TargetScan(http://www.targetscan.org/)[6]、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和DIANA-microT-CDS(http://diana.imis.athena-innovation.gr/)[7]預測miR-3934-5p的靶基因。為了提高預測的可靠性，通過Venn圖鑒定了重疊的靶基因。使用STRING(http://string-db.org/)數據庫構建這些基因的 蛋白互作(protein protein interaction,PPI)網絡，截止標準為綜合得分>0.9。 Cytoscape 3.7.2軟件的cytoHubba插件用于識別PPI網絡的關鍵基因，然后使用R包“ Clusterprofile”包對這些基因進行基因本體(GO)富集分析和《京都基因與基因組百科全書》(KEGG)通路富集分析[8]。臨界標準包括基因計數≥5和P<0.05。

1.3 統計學方法 統計分析使用SPSS 24.0軟件包。2組間的計量資料比較采用成組t檢驗或配對樣本t檢驗，分類資料比較采用卡方檢驗，等級資料比較采用Wilcoxon秩和檢驗。二分類Logistic回歸分析miR-3934-5p的表達與GC病人臨床特征之間的關系。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 從TCGA數據庫中共下載446名具有詳細臨床資料的GC病人數據。年齡30～90歲，平均(65.7±10.8)歲。按照miR-3934-5p表達的中位數將病人分為低表達組和高表達組，其中位年齡分別為65.0歲和68.5歲，差異有統計學意義(P<0.05)。此外，低表達組Grade分級分布與高表達組的差異有統計學意義(P=0.028)。見表1。

2.2 miR-3934-5p在GC組織中的表達及與臨床特征的關系分析 limma包分析結果顯示，與正常組織相比，miR-3934-5p在GC組織中表達上調(P<0.001)；在配對樣本中，正常組織和GC組織的miR-3934-5p表達差異具有統計學意義(P<0.001)。見圖1。

注：a:非配對樣本散點圖；b:配對樣本散點圖；***P<0.001圖1 正常組織和GC組織中miR-3934-5p的表達情況

2.3 不同臨床特征的GC病人中miR-3934-5p的表達水平 UALCAN分析了不同臨床特征的GC病人中miR-3934-5p表達水平，結果顯示，miR-3934-5p表達上調與年齡、Grade級別和TP53突變相關(P<0.05)，提示miR-3934-5p在GC中發揮了重要作用。見圖2。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖2 UALCAN分析miR-3934-5p在不同臨床特征GC中的表達箱形圖

2.4 miR-3934-5p高表達與臨床特征的二分類Logistic回歸分析 二分類Logistic回歸分析表明，miR-3934-5p的高表達與年齡(OR=1.901, 95%CI：1.302～2.787,P<0.001)、T分期(OR=0.585,95%CI:0.378～0.899)顯著相關。見表2。

表2 miR-3934-5p高表達與臨床特征的二分類Logistic回歸分析

2.5 miR-3934-5p水平對GC的潛在診斷價值及對老年GC病人預后的影響 使用ROC曲線分析評估miR-3934-5p對GC診斷的敏感度和特異度(圖3a)，結果顯示，miR-3934-5p的AUC為0.808，95%CI為0.743～0.872，最佳截斷值為0.517，靈敏度為0.854，特異度為0.622，說明miR-3934-5p具備較好的區分GC的能力，可作為臨床診斷GC的潛在生物標志物。此外，對年齡>65歲的GC病人進行生存分析(圖3b)，結果顯示，與miR-3934-5p低表達組相比，miR-3934-5p高表達病人的總體生存率較差，差異有統計學意義(P=0.024)。見圖3b。

注：a:ROC曲線分析miR-3934-5P在GC中的診斷價值；b:>65歲病人中miR-3934-5P高、低表達組Kaplan-Meier生存曲線圖圖3 miR-3934-5p在GC中的診斷價值及預后意義

2.6 miR-3934-5p的靶基因預測及GO/KEGG富集分析結果 通過TargetScan、miRDB、miRWalk和DIANA等數據庫對miR-3934-5p的靶基因進行預測并取交集，共檢測到182個重疊基因(圖4a)。使用STRING數據庫構建這些基因的PPI網絡，然后通過Cytoscape 軟件的cytoHubba插件可以識別關鍵基因，前13個最重要的基因分別是YY1、BRCA1、HDAC3、RBBP4、POU2F1、ASH2L、STAG1、TOPBP1、RAD1、FOXK1、MAML2、MECP2、TAOK1。對這些基因進行GO/KEGG富集分析，結果如圖4b所示，這些基因主要與p53介導的細胞信號轉導途徑、細胞周期、細胞衰老、DNA復制、同源重組等相關。表明miR-3934-5p可能在GC發生和發展中起重要作用。

注：a：使用miRWalk、DIANA、TargetScan和miRDB數據庫預測的miR-3934-5p靶基因；b：GO和KEGG通路富集分析結果;BP:生物過程；CC:細胞成分；MF:分子功能圖4 miR-3934-5p的靶基因預測及GO/KEGG富集分析結果

3 討論

GC是全球最常見的惡性腫瘤之一，盡管在GC的診斷和治療方面已取得很大進展，但5年總生存率仍然很差(約20%～25%)[9]。在中國，GC的發生率僅低于肺癌，其死亡率僅次于肺癌和肝癌。大多數早期GC病人無癥狀，并且在診斷時常常已發生遠處轉移[10]。因此，迫切需要研究GC發生和發展的潛在機制，以實現GC的早期診斷，有效治療和提高預后。

miRNAs是一組長度為18～25個核苷酸，miRNA可通過結合相應的3′非翻譯區(3′UTR)來抑制相應mRNA的翻譯，從而在轉錄后水平上調節基因的表達[11]。越來越多的證據表明，miRNA可以調節許多生物學功能，包括器官發育、細胞凋亡、腫瘤發生、增殖、應激和脂肪代謝[12]。先前已有研究表明，哮喘病人的外周血單個核細胞(PBMC)中miR-3934水平顯著降低，重度哮喘與輕度哮喘病人相比，PBMC中miR-3934水平顯著降低[13]。Ye等[2]發現下調的miR-3934-5p通過直接調節TP53INP1的表達顯著抑制神經母細胞瘤細胞的活力并誘導細胞凋亡。此外，miR-3934-5P的表達與非小細胞肺癌(NSCLC)病人的存活率和腫瘤發展相關，miR-3934-5p在NSCLC中上調，抑制miR-3934-5p可以增強NSCLC細胞對順鉑的敏感性，miR-3934-5p可能成為NSCLC的治療靶標[14]。但是miR-3934-5p在GC中的作用仍不清楚。

近年來，多種生物信息學方法為發現與腫瘤發生、診斷和預后相關的生物標志物做出了巨大貢獻，多種生物信息數據庫的組合用于癌癥分析也取得了一些突破[15]。生物信息學分析方法可以克服由于個體研究中不同的樣本量或微陣列平臺而導致的文獻中不一致的結果。目前關于miR-3934-5p的功能作用報道較少，尤其miR-3934-5p在GC中的功能機制未見任何研究。

本文研究了miR-3934-5p在GC中的潛在臨床意義，發現GC病人中miR-3934-5p表達顯著升高，miR-3934-5p高表達可用于區分GC和正常人群。對GC病人總體生存率進行分析發現，65歲以上人群中miR-3934-5p高表達與不良預后相關。本文通過UALCAN分析提示miR-3934-5p表達上調與年齡、Grade級別和TP53突變相關，此外隨著腫瘤分期進展，miR-3934-5p表達似乎呈現先升后降的趨勢，提示miR-3934-5p可能在GC早期發揮更為重要的作用或通過某些機制觸發腫瘤形成，其中具體作用機制尚待進一步研究。GO/KEGG富集分析表明miR-3934-5p調控了一些重要的生物學功能，例如，p53介導的細胞信號轉導途徑、細胞周期、細胞衰老、DNA復制、同源重組等，提示miR-3934-5p可能是促進GC發生的因素，并參與GC的發生和發展，有可能成為新的治療靶標。

本文存在一定的局限性，首先，本研究缺乏相應的實驗和臨床驗證；其次，無法消除不同組織學類型對結果影響的可能性。因此，后續可進行實驗驗證miR-3934-5p對GC細胞增殖、腫瘤生長等方面的影響并探討其機制。綜上所述，本研究利用生物信息分析的方法最終認為miR-3934-5p可能是GC中潛在的促癌因素，同時生存分析說明miR-3934-5p可能成為預測老年GC病人預后的一個重要的生物學指標。這些發現可能為GC病人臨床治療發現新的靶點提供一定的理論依據。