復合菌群利用模擬APG協同FNA預處理剩余污泥水解液合成PHA

王娜，宋秀蘭，昝博韜

（1 太原理工大學環境科學與工程學院，山西 太原 030024；2 University of Washington,Seattle,USA）

聚羥基烷酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是一種典型的由微生物直接合成的可降解生物塑料。PHA 主要有兩種類型：聚羥基丁酸酯（PHB）和聚羥基戊酸酯（PHV）。它可以由產PHA菌群以短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）為碳源合成，當細菌的生長過程中缺乏必需的氮、磷、微量元素或受重金屬的脅迫時，其可以作為細菌體內的碳源和能源儲存物質被重新利用。PHA具有傳統塑料所沒有的生物降解性、生物相容性等，用它替代石化塑料可以使二氧化碳排放量最小化和減少塑料在自然環境中的積累，進而減輕對環境的污染。

活性污泥厭氧發酵產生的短鏈脂肪酸既可作為廉價碳源用于PHA生產，也可以作為廢水生物脫氮除磷處理中微生物的必要碳源。游離亞硝酸（free nitrous acid，FNA）是一種可再生、低成本的厭氧消化液硝化產物， 烷基糖苷（alkyl polyglucose，APG）是一種易降解的對環境友好的生物表面活性劑，這兩種物質均可有效地促進污泥的溶解和水解，提高污泥產酸。楊黎俊采用FNA預處理協同APG處理剩余污泥，在溫度30℃、FNA 預處理2 天后加入APG、初始發酵pH=7.00、APG 投 加 量 為0.075gAPG/gVSS、 FNA 濃 度 為0.653mg/L、發酵5天條件下，SCFAs產量最大，為(324.94±1.98)mgCOD/gVSS，表明通過FNA 預處理協同APG 處理剩余污泥能夠強化產酸，可以低成本地提供碳源用于PHA 的合成。不同的處理污泥方式導致水解液中SCFAs 組成變化，進而影響PHA的合成量。

本文根據楊黎俊FNA預處理協同APG處理剩余污泥的最佳產酸條件下水解液SCFAs組成，啟動兩種不同接種污泥的序批式反應器（SBR）富集PHA 產生菌，研究活性污泥復合菌群以模擬FNA預處理協同APG 處理剩余污泥水解液為底物PHA合成效果，并采用批次合成實驗，考察pH、C/N和C/P 對PHA 合成量的影響，探究實際的FNA 預處理協同APG 處理剩余污泥水解液為底物時PHA合成效果。

1 材料和方法

1.1 PHA產生菌富集裝置

采用有效容積為2L 的SBR 反應器，按照傳統的好氧及底物充盈/匱乏（feast/famine，也稱ADF模式）交替環境下富集PHA 產生菌。SBR 配有攪拌、曝氣、進出水恒流泵以及在線pH、溶解氧（DO）監測系統。SBR 的運行周期為12h（進水10min、反應555min、沉淀90min、排水10min）；水力停留時間HRT=1 天；污泥停留時間SRT=10天。試驗裝置如圖1所示。反應階段同時進行曝氣和攪拌，空氣流速60～80L/h，攪拌采用機械攪拌，攪拌轉速為120r/min。

圖1 試驗裝置圖

1.2 PHA產生菌富集的污泥來源和接種馴化

采用序批式SBR 反應器富集PHA 產生菌，啟動了兩組接種不同接種污泥的SBR 反應器。SBR1接種太原市豪峰污水處理廠二沉池污泥，接種污泥濃度為5120mg/L；SBR2接種以葡萄糖為底物馴化成熟的產PHA混合菌，接種污泥濃度為3650mg/L。因實際污泥水解液含有SCFAs、多糖、溶解性蛋白質、氨氮和磷酸根等，成分復雜，對富集PHA 產生菌不利，且實驗室設備難以穩定供給富集階段所需大量水解液；所以試驗采用人工配水，以乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸、戊酸為碳源，氯化銨為氮源，磷酸二氫鉀為磷源。乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸、戊酸的比例根據楊黎俊采用APG協同FNA預處理剩余污泥最佳產酸條件下的水解液SCFAs組成確定，見表1。以模擬FNA預處理協同APG處理剩余污泥所得水解液為底物，控制化學需氧量COD=1200mg/L，C∶N∶P=100∶6∶1（質量比，下同），碳源和氮源成分組成如表2所示。另外加微量元素營養液0.5mL/L，其配料表如表3 所示。添加0.04g/L 硫脲抑制硝化作用。

表1 FNA預處理協同APG處理剩余污泥水解液SCFAs成分

表2 碳源、氮源組成

表3 微量元素營養液配料表

1.3 實驗方法

SBR 的取樣周期為5～7 天，取樣時間貫穿整個曝氣反應期。周期開始時測定反應器污泥濃度，隨后取樣按照“先密后疏”的方法進行取樣，并在線監測DO，開始階段每隔5～10min取樣，DO突躍點之后可適當延長，取樣間隔時間可逐漸從30～50min延長至90～100min。

PHA 合成批次試驗是以SBR 反應器排泥為種泥，以模擬FNA 預處理協同APG 處理剩余污泥的水解液為底物。實驗前對種泥進行1h 的預曝氣，確保剩余污泥中的氨氮等營養物質被耗盡，以免對試驗干擾。PHA 合成實驗在500mL 燒杯中完成，采用批次補料方式。每批次添加200mL 底物（只含碳源，不含氮磷源），底物濃度為2400mgCOD/L，曝氣反應時間為1.5h，結束后停止曝氣，靜沉，排除200mL 上清液之后進入下一批次實驗。如此循環5 個周期，實驗過程在線監測DO，每一批次的開始及結束均要及時取樣，在反應開始以及最后一個批次結束后各取樣測一次污泥濃度。

1.4 實際污泥水解液中氮、磷去除及PHA合成

試驗所用污泥來自太原市楊家堡污水處理廠二沉池污泥，污泥取回在4℃的冰箱中沉淀濃縮24h，配成12g/L的污泥。采用6個500mL血清瓶，每個添加450mL污泥，加入FNA濃度0.653mg/L，預處理2天，預處理過程調節pH 保持為6；預處理后投加APG，投加量為0.075gAPG/gVSS，調節pH為7，所有血清瓶用氮氣吹掃5min后，立刻用橡皮塞密封，放置在溫度為(30±1)℃的恒溫空氣搖床中進行厭氧發酵。發酵5天，離心分離后獲得實際污泥水解液。

實際的FNA 協同APG 處理剩余污泥水解液中除含有SCFAs、蛋白質、糖類等有機組分外，還含有氨氮和磷酸根，會影響PHA 合成，因此向實際污泥水解液中投加鎂鹽去除其中氮和磷。在溫度25℃、pH 為11.0、Mg/P 為2.6/1mol/mol、=10min條件下，進行脫氮除磷處理，然后經離心分離后，上清液用于進行PHA 合成批次試驗，實驗方法同1.3節，上清液性質見表4。

表4 鳥糞石沉淀法去除氮磷后的水解液的基本性質

1.5 分析項目和方法

2 結果和分析

2.1 富集反應器運行工況監測

SBR 富集反應器作為整個三段式PHA 合成工藝的核心裝置，對其運行穩定性的要求是最基本也是最重要的，富集反應器的運行穩定性主要通過其中活性污泥的物理性狀來表現。以SVI、MLSS 作為反應器穩定運行工況控制指標綜合評價富集體系的運行穩定性，SBR1、SBR2 富集反應器運行結果如圖2所示。

圖2 SBR富集反應器啟動期污泥穩定性相關參數變化

由圖2 可以發現，SBR1 在啟動初期SVI 一直處于200mL/g左右，有輕微的污泥膨脹現象。由于前期為了抑制污泥膨脹加NaCl 導致第11～15 天污泥濃度突然升高，停止加藥后污泥濃度逐漸開始下降，經過60 天的培養逐漸達到穩定，污泥濃度保持2.5g/L。污泥沉降性SVI在馴化過程中反復波動，活性污泥膨脹嚴重，SVI 值最高達到397mL/g，經鏡檢排除絲狀菌膨脹。通過改善系統曝氣均勻性，污泥沉降性能好轉，最終SVI 值穩定在130mL/g。SBR2反應器接種污泥為以葡萄糖為底物富集的馴化污泥，更換碳源后污泥的沉降性變差，SVI值很長時間內維持在200mL/g。經過100 天的馴化，污泥濃度維持在2～3g/L，SVI 維持在120mL/g 以下。SBR2的污泥濃度和SVI波動相對SBR1更加平穩。

2.2 富集反應器富集效率評估

2.2.1 富集反應器周期內PHA合成效率

觀察了每組反應器在富集第30 天、第60 天和第117天時周期內的DO、PHA、COD、SCFAs等參數變化情況，并依據所測得的相關參數計算PHA轉化率以及PHA比合成速率，其結果見圖3。

圖3 SBR富集反應器周期內最大PHA合成量

圖3 為不同SBR 富集反應器不同階段突躍點PHA 合成量，即為富集階段沿程取樣過程中PHA產量最高的點。由圖3中可知，隨著富集時間的推移，兩組SBR的富集效果都在不斷提升，SBR1中PHA 產量由30 天的5.95%上升至117 天的12.93%，SBR2中PHA產量由30天的6.88%上升至117天的11.48%。相對于SBR1，SBR2 富集階段沿程取樣中30～60天PHA產量較高，但隨著富集時間的推移SBR1的最大PHA 含量逐漸增大，直至第117天時相比SBR2高1.45%。

2.2.2 富集反應器污泥批次實驗PHA合成效率

在對富集反應器進行周期內PHA 合成效率研究的同時，對2組反應器周期內排出的污泥在限制營養的條件下進行了PHA 合成的批次實驗，通過考察批次實驗中的最大PHA 積累量、PHA 比合成速率、PHA 轉化率，考察富集階段的污泥應用于PHA 生產階段時其實際PHA 合成能力高低，結果見圖4及表5所示。由2.2.1節可知在周期沿程取樣中兩個反應器最大PHA 合成量（突躍點）都隨富集時間的推移而增大，但在使用SBR 反應器排泥進行批次合成實驗時，SBR2的PHA累積合成含量變化趨勢反而出現了隨時間下降的現象。這可能是由于馴化污泥在SBR 反應器中富集時間過長，導致有一定的老化污泥沉積，導致活性降低，進而影響后續批次合成中PHA 合成潛力。SBR1 的PHA累積合成含量出現先下降后上升的趨勢，先由36.77%（30 天）降至28.87%（60 天），這是由于第60 天時，SBR1 在第60 天突然出現了污泥膨脹現象，SVI 高達330mL/g，對反應體系中的微生物有一定沖擊，進而導致PHA 合成菌的合成能力降低，之后反應器污泥通過自我恢復沉降性能好轉，所以富集117天時SBR反應器排泥進行批次合成試驗的合成潛力升高，PHA 累積合成含量達到51.66%。與表5 中研究成果對比，這個產量與污泥堿性厭氧消化液做碳源合成PHA產量較接近。但是FNA 協同APG 處理污泥獲得碳源方法較污泥堿性厭氧消化成本低，不需要防腐蝕。SBR2在第30 天時PHA 累積合成含量最高，可以得出，短時間內，接種馴化污泥比接種回流污泥能夠更好富集PHA 合成菌。以上結果表明以二沉池污泥為種泥進行一段時間的培養富集可實現較大的合成批次PHA 產量，以葡萄糖為底物馴化成熟的產PHA 混合菌作為種泥可在短期內使微生物適應新環境，完成PHA 合成菌的富集，達到較高的批次合成PHA產量，但在漫長的富集中，可能會出現污泥性能惡化，導致PHA 合成效率稍有降低。因此后續的PHA合成工藝的控制條件優化采用SBR1富集反應器污泥為研究對象。

圖4 富集期SBR富集反應器批次實驗中PHA累積合成量

表5 文獻中的PHA合成量匯總

2.3 PHA合成工藝的控制條件優化

以SBR1富集反應器期試驗結束后排出的污泥為批次試驗菌種，以模擬FNA預處理協同APG處理剩余污泥的水解液為底物，探索pH、C/P和C/N對PHA合成的影響，以確定最優的pH、C/P和C/N。

2.3.1 pH對PHA合成的影響

不同pH 下，使用模擬碳源進行批次合成試驗研究結果如圖5 所示。在前兩個批次中，pH=6 時的PHA累積合成量大于其余兩個pH時的，而在第三個批次開始，PHA 合成量明顯低于其余條件，這可能是由于經過兩次進料反應后，反應體系中酸度積累，抑制了PHA 合成菌的活性，進而引起微生物攝取有機物的速率降低，導致微生物合成PHA的含量降低，僅為45.31%。pH=8時的合成效果比pH=7 時好，最終PHA 累積合成量為51.14%，比pH=6 時高出6%左右。一些文獻研究了pH 對PHA生產過程的速率和效率的影響。有研究發現，當酸堿度控制在8.0～9.0 時，可以觀察到較高的PHA 生產率；有的研究表明在酸堿度為6.90時，有利于生產PHA。在本試驗中，對PHA 合成的最佳pH為8。蔡萌萌也發現在弱堿性條件下有助于提高PHA 產量。本文結論與蔡萌萌的研究結果一致。在不同pH條件下，PHB與PHV的組分占比并未有太大變化，PHB/PHV 都為1.14 左右。模擬APG 協同FNA 預處理剩余污泥的水解液中乙酸、丁酸比例和為61.32%，丙酸、戊酸比例和為38.68%。乙酸、丁酸有利于PHB 合成，丙酸、戊酸有利于PHV 合成。模擬APG 協同FNA 預處理剩余污泥水解液SCFAs 組成對PHB/PHV 比例有一定影響。

圖5 不同pH下合成批次試驗的PHA累積合成量情況

2.3.2 碳磷比對PHA合成的影響

在pH=8 的基礎上，考察反應器在C/P 為100∶0.03、100∶0.5 和100∶1 時PHA 積累情況，結果見圖6。在限磷條件下，PHA產量有一定提高，在C/P=100∶1 時，PHA 為38.77%，其中PHB 的含量占到PHA 含量的60%。在C/P=100∶0.5 時，PHA的含量較C/P=100 時有顯著提高，PHA 合成量為48.46%。進一步限制磷濃度使C/P 達到100∶0.03時，PHA 為53.25%，其中PHB 的含量占到PHA 含量的52.23%。總體來說，隨著進水底物中磷濃度的減少，批次合成試驗的PHA 含量升高。許多研究表明較低的磷濃度會促進聚羥基烷酸酯的最大積累，這與本試驗研究結果一致。此外可以觀察到，隨著C/P 的增大，PHB/PHV 減小，即PHV 含量隨著磷的增加有顯著降低，PHB 含量降低不明顯，這表明限磷過程對污泥合成PHV 的影響較PHB影響更大。

圖6 不同C/P下合成批次試驗的PHA累積合成量情況

2.3.3 碳氮比對PHA合成的影響

在pH=8、C/P=100∶0.03的基礎上，考察反應器在C/N為100、125和150時PHA積累情況，結果見圖7。在C/N 為100 時，PHA 含量為38.84%，其中PHB 的含量占到PHA 含量的53.9%。進一步限制氮濃度使C/N 達到125 時，PHA 產量顯著提高，PHA 含量為57.34%，其中PHB 的含量占到PHA 含量的56.26%。而當進一步將氮濃度減少到C/N為150 時，PHA 的含量反而降低。一些研究表明，C/N=125時能夠獲得最大PHA合成量，本試驗研究結果與他們的結果吻合。同時，圖8 中可以觀察到C/N=100∶1 時，隨著批次的進行，每個批次進料的底物消耗量逐漸減少，導致底物也逐漸積累，最后一個批次中，對底物的消耗量低于其余兩種條件，甚至不足C∶N=150∶1條件下的一半。C/N=100時，反應體系內揮發酸在每次進料后消耗量都較少而導致揮發酸積累過多，進而引起底物抑制作用，引起微生物攝取有機物的速率降低，導致微生物PHA 合成率降低。過低的碳氮比會導致較低的碳源消耗速率和提高細胞生長速率，隨之導致了PHA 的合成速率降低。氨氮作為細胞生長的限制性因素，碳氮比升高，氮源含量相對減少，會降低細胞生長速率，提高PHA 合成菌的合成速率，從而提高PHA 的產量。綜上所述，在本次試驗中可以得出PHA 合成批次試驗的最佳條件為：pH=8，C∶P=100∶0.03，C∶N=125。

圖7 不同C/N下合成批次試驗的PHA累積合成情況

圖8 不同C/N下合成批次試驗的底物消耗情況

2.4 實際污泥水解液合成PHA

將去除氮、磷的實際水解液進行PHA 的批次合成實驗，結果如圖9所示。由圖9可知，隨著批次進料的推移，PHA累積合成量呈現上升的趨勢，由反應開始的2.64%升至最后一次補料結束后的24.43%，PHB與PHV含量分別為16.62%和7.82%。

圖9 實際污泥水解液合成批次試驗中PHA含量的變化規律

實際污泥水解液做底物時PHA 累積合成量與模擬污泥水解液做底物的最佳條件下PHA 累積合成量（57.34%）差距較大，原因可能是以下幾點：①進行批次合成試驗的污泥菌群并未經實際污泥水解液在SBR 反應器中馴化，當實際污泥水解液作為底物時，混合菌群由于對反應體系環境的不適應，導致對底物攝取速率較慢，進而導致了PHA合成率的下降；②實際污泥水解液中溶解性有機物除了可以作為碳源的SCFAs，還含有蛋白質、多糖等物質，對微生物的碳源的攝取速率造成一定影響，進而對PHA的合成效果產生影響，賈倩倩和趙麗智的研究結果也佐證了這一猜想；③實際污泥水解液進行脫氮除磷時，未能將氮、磷含量減少至最佳PHA 合成條件，導致了體系中難以達到最佳的PHA合成效果。

3 結論

本文啟動兩種不同接種污泥的序批式反應器（SBR），按照ADF 模式富集PHA 產生菌，研究活性污泥復合菌群以模擬APG 協同FNA 預處理剩余污泥的水解液為底物的PHA 合成效果，考察了批次合成實驗中pH、C/P和C/N比對PHA合成量的影響，探究了實際的APG 協同FNA 預處理剩余污泥的水解液為底物時PHA 合成效果，得到的結論如下。

（1）不同接種污泥類型對反應器富集馴化有一定影響，短時間內，接種以葡萄糖為底物馴化成熟的產PHA 混合菌的SBR2 能夠更好富集PHA 合成菌，獲得較高的PHA 合成量。但隨著馴化時間的延長，接種二沉池污泥的SBR1得到的PHA產生菌性能更優。

（2）以模擬FNA 預處理協同APG 處理剩余污泥水解液為底物，COD 濃度為1200mg/L、馴化時長達117天時，接種二沉池污泥的得到的PHA產生菌反應器周期監測中PHA 最大合成量為12.54%，合成批次試驗的PHA合成量為51.66%。

（3）模擬FNA預處理協同APG處理剩余污泥水解液為底物時，PHA合成最佳條件為：pH=8，C/P=100∶0.03，C/P=125∶1。此 時PHA 合 成 量 為57.34%。

（4）實際的APG 協同FNA 預處理剩余污泥的水解液為底物時，PHA的累積合成量為24.43%。