內質網應激前列腺癌細胞通過STAT3信號途徑促進巨噬細胞M2極化的研究

毛新志，童宏方，戴和平，淡彬志，朱 梅

（安徽醫科大學附屬巢湖醫院檢驗科，安徽 巢湖 238000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是美國男性癌癥死亡相關的第2 大原因[1]。早期的前列腺癌是一種局限性疾病，可以采用手術或者放射性治療[2]，而晚期的前列腺癌可以出現肝、肺和骨轉移，這是導致患者死亡的主要原因[3]。目前，現有的前列腺癌治療方法尚未有較大突破，因此，迫切需要尋找一種有效的前列腺癌治療方法。腫瘤的生長依賴于腫瘤微環境（TME），快速生長的腫瘤導致腫瘤微環境改變，引起腫瘤細胞產生內質網應激（ERS）[4]。研究表明[5]，ERS 可在各種腫瘤中被激活，且與腫瘤的發生和發展密切相關。巨噬細胞是一種高度可塑性細胞，可被所處環境激活為抗腫瘤活性的M1 型或促腫瘤活性M2 型巨噬細胞，在腫瘤微環境中主要表現為M2 型巨噬細胞[6]。有報道顯示[7]，發生ERS 的腫瘤細胞可以使巨噬細胞發生表型的轉變，表明ERS 與腫瘤微環境中巨噬細胞的極化有關系，但其相關機制尚不清楚。外泌體是直徑在30～150 nm 的分泌型囊泡，可被多種細胞分泌，其內含多種遺傳物質。腫瘤來源的外泌體可以使微環境中的巨噬細胞發生免疫表型和免疫功能的改變，進而有利于腫瘤免疫逃逸，但外泌體通過何種途徑對巨噬細胞產生影響目前尚不清楚[8]。信號轉錄和轉錄激活因子（STAT）蛋白是一個細胞質轉錄因子家族，其中的STAT3 參與許多生物學過程，可以被激活（通常為磷酸化），通過質膜上的受體將轉錄信號傳遞到細胞核[9]。有研究表明[10]，STAT3 信號通路在誘導THP-1 巨噬細胞M2 極化過程中發揮巨大作用，通過抑制STAT3 信號通路，可以恢復對腫瘤的免疫監測。本研究旨在探討內質網應激前列腺癌細胞分泌的外泌體，能否通過上調巨噬細胞的STAT3 通路蛋白，進而改變巨噬細胞的免疫表型，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 前列腺癌細胞（PC3）和人單核細胞白血病細胞（THP-1）均購于中科院上海細胞庫；DMEM培養基（以色列Biological industries 公司）；RPMI 1640 培養基（美國Gibco 公司）；胎牛血清（加拿大Wisent 公司）；外泌體提取試劑盒（Exo－Quick-TC）、無外泌體胎牛血清、CD63 單克隆抗體均購于美國SBI 公司；DAPI 染核液、PKH67 綠色熒光細胞膜標記試劑盒、佛波酯（PMA）、毒胡蘿卜素（TG）均購于美國Sigma 公司；兔抗GRP78（美國Bioworld 公司）；鼠抗TSG101 單克隆抗體（英國Abcam 公司）；兔抗PD-L1（美國ABclonal 公司）；兔抗Calnexin 單克隆抗體、兔抗Phospho-Stat3 抗體、兔抗Stat3 抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司；鼠抗GAPDH 單克隆抗體、羊抗兔IgG（HRP）抗體、羊抗鼠IgG（HRP）抗體均購于武漢三鷹生物技術公司。

1.2 主要儀器和設備 無菌細胞操作臺購于蘇凈安泰公司；電泳儀、垂直電泳槽購于北京六一儀器廠；Image Quant LAS 4000 發光成像系統購自美國GE公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；激光共聚焦顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及分組 PC3 細胞以DMEM（高糖）完全培養基（10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）、THP-1 細胞以RPMI1640 完全培養基（10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）于飽和濕度37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每48 h 換液1 次，待細胞長至80%～90%時，對細胞進行傳代。將培養完成的PC3細胞以有無TG 刺激分為空白對照組（Con 組）和TG 刺激組（TG 組）。

1.3.2 巨噬細胞的誘導及分組實驗 所用巨噬細胞以50 ng/ml 濃度的PMA 誘導48 h 獲得。將誘導完成的巨噬細胞根據加入不同的外泌體刺激進行分組，分為Con 組PC3 細胞外泌體刺激組（M-Con 組）與TG 組PC3 細胞外泌體刺激組（M-TG 組）。

1.3.3 蛋白印跡實驗 取對數生長期的PC3 細胞或者THP-1 細胞，接種到6 孔板中，待細胞貼壁后，根據不同實驗目的分別進行處理：①以不同濃度（0、1、2、2.5、3、4 μmol/L）TG 刺激PC3 細胞24 h，后用3 μmol/L 濃度TG 以不同時間（0、6、12、24、48 h）刺激PC3 細胞，觀察PC3 細胞GRP78 蛋白表達情況，確定TG 最佳刺激濃度與時間；②培養Con 組PC3細胞和TG 組PC3 細胞及其分泌的外泌體，觀察PC3細胞及其分泌外泌體中CD63、TSG101 與Calnexin 蛋白表達情況；③以不同濃度（10、20、30、40 μg/ml）外泌體刺激巨噬細胞24 h，后用30 μg/ml 濃度外泌體以不同時間（0、6、12、24、48 h）刺激巨噬細胞，觀察巨噬細胞PD-L1 蛋白表達情況，確定外泌體最佳刺激濃度與時間；④培養M-Con 組和M-TG 組巨噬細胞，檢測巨噬細胞P-STAT3 和STAT3 蛋白表達情況。收集各組細胞，提取各組細胞蛋白，用BCA 試劑盒進行蛋白定量，后加入5x 蛋白上樣緩沖液，配制SDS-PAGE 凝膠，各孔中等量蛋白上樣，經電泳分離、轉膜等步驟后將蛋白轉至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗膜后分別與相應一抗（GRP78抗體1∶3000 稀釋；CD63 抗體、TSG101 抗體、Calnexin 抗體、PD-L1 抗體、P-STAT3 抗體、STAT3 抗體稀釋比例均為1∶1000；GAPDH 抗體1∶20000 稀釋）孵育過夜，經洗膜3 遍、二抗室溫孵育1 h、洗膜3 遍后，發光成像系統顯影。

1.3.4 外泌體的提取 分別收集Con 組和TG 組PC3細胞的培養上清，3000xg 離心15 min 去除細胞碎片，吸取上清于新的離心管中，分別加入外泌體提取試劑（ExoQuick-TC），提取Con 組分泌外泌體（Exo-Con）和TG 組細胞分泌外泌體（Exo-TG），后續進行透射電鏡和蛋白印跡實驗對兩組外泌體進行鑒定。

1.3.5 透射電鏡觀察外泌體 將制備好的外泌體從-80 ℃冰箱取出，冰上自然解凍；取10 μl 于銅網正面，磷鎢酸復染1～2 min，自然晾干，PBS 沖洗3 遍，自然晾干后透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態。

1.3.6 激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞 對外泌體的攝取用PKH67 按照試劑說明書標記PC3 細胞分泌的外泌體，加入誘導后的THP-1 細胞培養皿中，于飽和濕度、5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中共培養12 h，用預冷的PBS 洗細胞3 次，4%多聚甲醛固定30 min，棄甲醛后PBS 再次洗3 遍，后0.2% Triton-100 破膜10 min，再次PBS 洗細胞3 次，血清封閉30 min，再次PBS 洗3 遍，DAPI 染核5 min，PBS 洗3 遍后激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.7 化學發光法檢測細胞炎癥因子 用外泌體和誘導后的巨噬細胞共培養，取其上清液利用化學發光方法檢測Exo-con 和Exo-TG 對巨噬細胞IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 表達水平的影響。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 5.0 軟件進行分析，計量數據采用（）表示，兩組間比較采用配對t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義，P＜0.01 表示統計學意義顯著。

2 結果

2.1 毒胡蘿卜素誘導PC3 細胞內質網應激結果 TG可刺激PC3 細胞增加GRP78 蛋白表達，且PC3 細胞分泌ERS 標志蛋白GRP78 可呈濃度依賴性（圖1A，1B）和時間依賴（圖1C，1D）表達增加，當濃度為3 μmol/L 時，GRP78 分泌量達最大（P＜0.05），見表1；而12 h 時與24 h 時GRP78 分泌量增加不明顯（P=0.051），見表2。

圖1 毒胡蘿卜素誘導PC3 細胞內質網應激

表1 各組濃度相對比較（）

表1 各組濃度相對比較（）

注：與3 μmol/L 組比較

表2 各組時間相對比較（）

表2 各組時間相對比較（）

注：與24 h 組比較

2.2 外泌體的鑒定及巨噬細胞對外泌體的攝取 透射電子顯微鏡觀察可見Exo-Con 和Exo-TG 均為雙層膜樣結構、圓形或類圓形小囊泡，直徑為30～120 nm，大小均一散分布，符合文獻報道外泌體典型特點，見圖2A、2B；Western blot 結果顯示，提取的Exo-Con 中和Exo-TG 中均表達CD63 和TSG101外泌體標志蛋白，且無內質網分子蛋白Calnexin 的表達，見圖2E；另外，Con 組與TG 組PC3 細胞中CD63、TSG101 和Calnexin 蛋白升高表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2C、圖2D、表3；而與Exo-Con 比 較，Exo-TG 中 標 志 性 蛋 白CD63 和TSG101 的含量較高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2E、圖2F、表4；激光共聚焦觀察結果顯示，DAPI 染核后的巨噬細胞能夠攝取PKH67 標記的外泌體，見圖2G。

表3 兩組PC3 中Calnexin、TSG101、CD63相對表達量比較（）

表3 兩組PC3 中Calnexin、TSG101、CD63相對表達量比較（）

表4 兩組外泌體中TSG101 與CD63相對表達量比較（）

表4 兩組外泌體中TSG101 與CD63相對表達量比較（）

圖2 外泌體的鑒定與巨噬細胞對外泌體的攝取

2.3 Exo-TG 上調巨噬細胞PD-L1 表達 Western blot 結果顯示，Exo-TG 可呈濃度依賴性（圖3A）和時間依賴性（圖3B）增加巨噬細胞PD-L1 的表達。且當Exo-TG 刺激濃度為30 μg/ml，刺激時間為24 h時巨噬細胞PD-L1 分泌量達到最大，見圖3C、圖3D；M-Con 組刺激濃度20、30 和40 μg/ml，M-TG組刺激濃度30、40 μg/ml，刺激12 h 和24 h 巨噬細胞PD-L1 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表5、表6；此外，與M-Con 組比較，M-TG 組能夠較明顯的增加巨噬細胞分泌PD-L1 蛋白（P＜0.05），見表7。

表5 不同濃度比較（）

表5 不同濃度比較（）

注：各組均與30 μg/ml 組比較

表6 各組時間比較（）

表6 各組時間比較（）

表7 兩組巨噬細胞PD-L1 相對表達量比較（）

表7 兩組巨噬細胞PD-L1 相對表達量比較（）

圖3 外泌體對巨噬細胞PD-L1 表達量的影響

2.4 Exo-TG 可促進巨噬細胞向M2 表型轉化 化學發光結果顯示，與M-Con 組相比，M-TG 組不僅能夠明顯升高炎癥細胞因子IL-1β 和TNF-α 的濃度水平，還能夠提高IL-10 表達（P＜0.05），但IL-6 濃度水平升高不明顯（P＞0.05），見圖4A、表8、表9。

表8 化學發光檢測IL-1β、IL-6、IL-10 與TNF-α 濃度水平（，pg/ml）

表8 化學發光檢測IL-1β、IL-6、IL-10 與TNF-α 濃度水平（，pg/ml）

表9 兩組巨噬細胞炎癥因子水平相對表達量（）

表9 兩組巨噬細胞炎癥因子水平相對表達量（）

圖4 化學發光法檢測巨噬細胞炎癥因子

2.5 Exo-TG 可上調巨噬細胞P-STAT3 的表達Western blot 結果顯示，與M-Con 組相比，M-TG 組中的STAT3 蛋白升高不明顯（P＞0.05），而P-STAT3蛋白升高（P＜0.05），見圖5A，且P-STAT3/STAT3 的比值升高（P＜0.05），見圖5B、表10。

圖5 外泌體對巨噬細胞STAT3 表達的影響

表10 兩組巨噬細胞STAT3 通路蛋白相對表達量比較（）

表10 兩組巨噬細胞STAT3 通路蛋白相對表達量比較（）

3 討論

由于腫瘤細胞的快速生長，可引發腫瘤微環境發生改變，如組織缺氧、營養不足、低pH 等，進而誘發腫瘤產生內質網應激，內質網應激已被證明在調節血管生成、炎癥、侵襲轉移和化療耐藥性中發揮重要作用[11]。外泌體是含有多種遺傳信息的載體，在腫瘤細胞和免疫細胞信息傳遞中發揮重要作用，可以介導巨噬細胞的分化，最終促進腫瘤的發展[12，13]。在腫瘤微環境中大多以M2 型巨噬細胞為主，且M2 巨噬細胞對腫瘤的進展及預后均有消極影響。有研究表明[14]，乳腺癌細胞來源的外泌體可以促進巨噬細胞向M2 表型轉化，促進乳腺癌的免疫逃逸。因此，內質網應激前列腺癌細胞也可能通過外泌體促進巨噬細胞M2 表型極化，具體機制仍需進一步研究。

葡萄糖調節蛋白（GRP78）存在于所有真核生物內質網膜上，在內質網應激情況下，GRP78 的表達增加[15]。本研究用TG 刺激前列腺癌細胞構建前列腺癌ERS 模型，結果表明，TG 能夠引起內質網應激蛋白GRP78 表達增加，且當以3 μmol/L 毒胡蘿卜素刺激前列腺癌細胞24 h 時，GRP78 蛋白表達量最高，這時能夠較好的構建前列腺癌ERS 模型。研究還發現，ERS 的前列腺癌細胞能夠分泌外泌體，并且ERS 的外泌體能夠表達更多的CD63 與TSG101，這表明ERS 可能致使外泌體攜帶更多的遺傳物質。目前巨噬細胞亞型可分為經典活化促炎M1 型和替代活化M2 型。根據相關文獻報道[16]，M2型巨噬細胞不僅能表達促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α，還高表達抗炎因子IL-10 和低水平的IL-12。在本研究中，內質網應激的PC3 細胞釋放的外泌體能夠被巨噬細胞所攝取，并分泌大量IL-1β、IL-10和TNF-α 細胞炎癥因子，說明內質網應激PC3 細胞外泌體能夠促進巨噬細胞向M2 表型極化；但IL-6 的分泌增加不明顯，這可能與內質網應激前列腺癌細胞外泌體同時促進巨噬細胞向M1 型M2 型的混合極化，這在黑色素瘤細胞中有相關報道[17]。腫瘤相關巨噬細胞的極化并不是一個靜態的，近年來，有研究發現通過調節NF-κB 通路能夠促進巨噬細胞M1 極化，抑制M2 極化[18]。在胰腺癌模型中，PI3K-γ 通路和CSF-1/CSF1R 的雙重阻斷可使M2型巨噬細胞轉變為M1 型巨噬細胞[19]。以上相關文獻說明巨噬細胞是可以被動態調控的，但具體相關機制有待進一步研究。本研究還發現，除了改變巨噬細胞免疫表型，高表達炎癥因子外，巨噬細胞中PD-L1 蛋白也被上調。而PD-L1 的上調又被證明能夠抑制CD8+T 細胞的細胞毒性，促進腫瘤免疫逃逸[20]。綜上所述，M2 極化巨噬細胞與腫瘤免疫密切相關，可以與抗腫瘤治療相聯系，作為輔助治療的潛在靶點。

STAT3 可在多種癌癥中被激活。有研究報道[21]，乳腺癌細胞來源的乳酸通過激活ERK/STAT3 信號通路誘導乳腺癌M2 巨噬細胞極化，從而促進乳腺癌進展。還有研究表明，乳腺癌細胞來源的外泌體通過gp130 通過激活巨噬細胞IL-6/STAT3 信號通路，誘導促腫瘤細胞因子的表達，從而使骨髓源性巨噬細胞向促腫瘤生長的M2 型巨噬細胞轉化[22]。以上研究表明，STAT3 在巨噬細胞M2 極化中發揮重要作用。在本研究中，來自內質網應激PC3 細胞的外泌體能夠使巨噬細胞STAT3 蛋白明顯磷酸化，而STAT3 蛋白表達升高不明顯，說明ERS 前列腺癌細胞外泌體可激活巨噬細胞STAT3 磷酸化蛋白通路，引起巨噬細胞向M2 型分化，并引起IL-1β、IL-10和TNF-α 的分泌增加和PD-L1 蛋白表達，從而發揮抗腫瘤免疫的功能，這與既往的研究[23]相符合。有研究表明[24]，在肺癌中，薯蕷皂苷可能作為一種潛在的IL-10 抑制劑，通過下調活化STAT3 的表達，抑制巨噬細胞M2 極化從而誘導抗腫瘤免疫。同樣的，在前列腺癌中，已有研究證明let-7b-5p 可以通過調節SOCS1/STAT 通路的活性來調節M1/M2 轉換，最終影響前列腺癌增殖[25]；這說明STAT3 是一個新的可控的調節位點，在未來有望成為一個新的治療靶點。

綜上所述，內質網應激的前列腺癌細胞能夠借助外泌體將應激信號傳遞給THP-1 巨噬細胞，引起巨噬細胞STAT3 的磷酸化，上調巨噬細胞PD-L1的表達，引起巨噬細胞M2 表型轉化，并分泌大量IL-1β、IL-10 和TNF-α 細胞炎癥因子，促進前列腺癌細胞的免疫逃逸，具體機制還要進一步研究。盡管僅限于體外模型，但這些結果證明了外泌體能夠在腫瘤細胞和免疫細胞中傳遞信息，并改變巨噬細胞免疫表型，促進癌癥的進展，也為治療前列腺癌提供了理論依據。