毫針針刺對SD大鼠腧穴筋膜組織CSK、ATP和PCNA影響

胡鐵漢，李 程，司原成，陳 波，張 婷，賴 清

（1.貴州中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省第二人民醫(yī)院中醫(yī)科，貴州 貴陽 550004）

毫針針刺（filiform needling）對腧穴的刺激作用在本質上是機械力刺激[1]。實驗針灸學研究證實，毫針針刺作用除了存在神經生物學機制外，還存在非神經生物學機制[1，2]。由于對腧穴非神經組織細胞如何感受和傳遞針刺機械力學信號尚缺乏研究，因此，針刺非神經生物學機制還存在諸多未知環(huán)節(jié)。為此課題組前期通過離體細胞實驗，屏蔽掉神經、體液各種環(huán)境因素，從始動環(huán)節(jié)觀察了各種力學刺激對腧穴筋膜組織成纖維細胞的影響和力學信號傳導通路（整合素-細胞骨架-細胞效應）的變化情況[3-5]。但是，活體生物的在體實際環(huán)境要復雜得多，因此，本實驗以大鼠腧穴筋膜組織為研究對象，以毫針對腧穴進行刺激，在體觀察腧穴筋膜組織CSK 在針刺力學信號傳導中的變化情況，并以ATP 和PCNA 為效應指標觀察腧穴筋膜組織能量代謝和細胞活力的改變情況，觀察細胞骨架在活體生物腧穴內傳導力學信號時的變化，旨在為毫針針刺作用機理提供新的實驗證據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 16 只雄性SPF 級SD 大鼠，8 周齡，體重（190±10）g。購自湖南長沙天勤生物技術有限公司，動物許可證編號：SCXK（湘）2014-0011。實驗方案通過貴州中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核。

1.2 主要試劑和藥品 抗actin、vimentin、tubulin、PCNA 抗 體（Abcam；型 號：Ab52614、Ab92547、Ab108342、Ab92522）、EnVision 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（Dako，型號：K5007）、水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司；批號：22011026）等。

1.3 主要器材 毫針（蘇州針灸用品有限公司；型號：13052）、電子天平（上海奧豪斯；型號：00000027）、半自動脫水機（Leica；型號：TP1020）、全自動石蠟包埋機（Leica；型號：EG1150）、全自動石蠟切片機（Leica；型號：RM2235）、顯微鏡（Olympus 型號：1*71）、數(shù)碼照相機（Nikon；型號：DS-Fil）、全自動酶標儀（美國寶特公司，型號：ELX808IU-P）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組處理 采用隨機數(shù)字表法將16 只SD大鼠分為空白對照組、毫針針刺組，每組8 只。兩組飼養(yǎng)條件一致，適應性飼養(yǎng)1 周后開始實驗。抓取空白對照組各只，用4%的水合氯醛按照4 ml/kg 進行麻醉，首次麻醉成功后用脫毛劑以中脘穴為中心3 cm 范圍內進行脫毛，然后放回盒中飼養(yǎng)。麻醉1 次/d，共3 d。抓取毫針針刺組大鼠麻醉和脫毛成功后，將大鼠仰臥位固定于鼠臺上，然后用30 號1 寸毫針在中脘穴處向胸部平刺，進針0.5 cm，以平補平瀉手法按照（60±3）r/min 均勻捻轉5 min，捻轉幅度在180°～360°，中間留針10 min，然后同樣的手法速率再捻轉5 min，留針10 min，共操作3 輪，然后出針，1 次/d，共3 d。

1.4.2 動物取材 第3 天末次操作后，各組大鼠分別繼續(xù)固定進行取材。以大鼠中脘穴穴點為中心，用外科剪剪取0.5 cm×0.5 cm 組織塊，切取其中一部分組織塊，迅速放入盛有4%多聚甲醛瓶中固定備測微絲、中間絲、微管和PCNA。另一部分組織塊（約200 mg）立即放入凍存管內，放入液氮罐中保存，待檢ATP。取材完畢后將大鼠脫頸處死。

1.4.3 免疫組織化學法檢測細胞骨架微絲、中間絲、微管和PCNA 表達 組織塊脫水、透明、浸蠟、包埋和切片（4 μm）后經二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化，PBS 洗滌；再用pH6.0 的0.01 mol/L 檸檬酸鈉抗原修復液修復，3%H2O2抑制內源性過氧化物酶室溫孵育；加入抗actin、vimentin、tubulin、PCNA 抗體4 ℃孵育過夜；經EnVision 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（二抗）37 ℃孵育、顯色、復染、封片后，在顯微鏡下觀察，應用Image pro plus6.0 軟件在同等參數(shù)設置下分別測定微絲、中間絲、微管的積分光密度值（integrated option density，IOD）和陽性區(qū)域面積（area），通過計算（IOD/area）平均光密度（mean density，MD）反應目標物質的單位面積濃度；PCNA 實驗圖片用直接觀察法計數(shù)PCNA 陽性細胞核數(shù)量和圖片中總的細胞核數(shù)量，PCNA 的陽性百分率=PCNA 細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，觀察各組的變化。

1.4.4 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測腧穴穴區(qū)組織塊中ATP 的含量 將備存的腧穴穴區(qū)組織塊進行勻漿，3000 g×10 min，取上清，在嚴格按照ATP 的檢測試劑盒的說明及流程進行操作，觀察各組腧穴穴區(qū)組織塊中的含量變化。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件分析，所有數(shù)據(jù)均以（）表示，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計學意義顯著。

2 結果

2.1 毫針針刺對腧穴筋膜組織CSK 表達的影響 針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 微絲、微管的表達低于空白組，統(tǒng)計學意義顯著（P＜0.01）；針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 中間絲的表達高于空白組，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.203），見表1、圖1。

圖1 兩組微絲、中間絲和微管表達情況（免疫組化，×400）（續(xù)）

表1 針刺對腧穴筋膜組織CSK 微絲、中間絲、微管表達的影響（，MD）

表1 針刺對腧穴筋膜組織CSK 微絲、中間絲、微管表達的影響（，MD）

注：與空白組比較，＊P＜0.01

圖1 兩組微絲、中間絲和微管表達情況（免疫組化，×400）

2.2 毫針針刺對腧穴穴區(qū)局部組織ATP 含量和PCNA 表達的影響 針刺組腧穴穴區(qū)局部組織ATP 含量及PCNA 陽性計數(shù)率均高于空白組，統(tǒng)計學意義顯著（P＜0.01），見表2、圖2。

表2 毫針針刺對腧穴筋膜組織ATP 含量和PCNA 表達的影響（）

表2 毫針針刺對腧穴筋膜組織ATP 含量和PCNA 表達的影響（）

注：與空白組比較，＊P＜0.01

圖2 兩組PCNA 表達情況（免疫組化，×400）

3 討論

力學微環(huán)境是調節(jié)生命形態(tài)和功能的重要因素之一[6]。現(xiàn)代生物醫(yī)學工程學研究證實，細胞能夠感知力的大小和時域（time scales），并且把機械刺激轉化為化學響應，進一步影響到細胞的DNA 轉錄、翻譯和表達[7-9]。目前，關于細胞如何將胞外力信號傳遞到胞內并且引起細胞反應應答的力信號傳導通路目前認為主要有3 種途徑：一是力敏感離子通道（stretch-sensitive ion channels），通過力敏感離子通道將力信號轉化成跨膜的電信號或胞內的化學信號[10]。針刺作用的神經生物學機制在闡釋針刺機械信號的導入和轉換時大多采用這一理論進行描述[1，11]；二是胞外基質和粘連分子，這些胞外基質和粘連分子將細胞和細胞，胞外和胞內聯(lián)系起來，形成一個整體，并將力信號從胞外傳遞到胞內，引起細胞的下游反應[12]。在針灸推拿作用的機制研究中，有研究證實體外模擬推拿之壓力刺激能促進血管內皮細胞的Integrinβ1、α1、α2、α3、αv表達量增加，Integrinβ3表達下降[13]；而毫針針刺對SD 大鼠腧穴穴區(qū)筋膜結締組織integrinβ1和integrinβ3的表達變化情況呈現(xiàn)不同趨向：中等強度毫針針刺時腧穴筋膜結締組織中integrinβ1的表達增強，有顯著差異，然而高強度毫針針刺時integrinβ1的表達卻下降。integrinβ3除部分大小血管可見少量表達外，在腧穴筋膜結締組織中始終為陰性表達[14]；三是細胞骨架的重新組建，當細胞受到外界機械力刺激以后，細胞骨架在一些調節(jié)因子作用下解聚重組，并進一步引起細胞反應應答。其中，針灸學領域以細胞骨架變化重組這一機械力信號傳導途徑的研究尚需深入。

細胞骨架[15，16]包括微絲、中間絲和微管3 種成分，是維持細胞形態(tài)功能的支柱性、剛性結構，同時也是許多蛋白激酶附著的位點。微絲由肌動蛋白組成，單個微絲直觀呈雙股、右手螺旋狀，實心，在細胞中成平行、二維、三維分布，處于高動態(tài)平衡狀態(tài)，與細胞的形態(tài)和運動有密切關系；中間絲化學成分復雜且性質較為穩(wěn)定，呈實心狀，其直徑在微絲和微管之間；微管主要由α、β 兩種微管蛋白組成，呈中空的管狀，它的直徑和微絲、中間絲比較是最大的，也處于高動態(tài)平衡狀，對細胞起著支撐的作用和參與胞內物質輸送的作用。細胞的形態(tài)需要依靠細胞骨架這些呈網狀的蛋白來維持，同時細胞骨架對細胞的很多重要生命活動如生長、分裂、物質運輸?shù)纫彩株P鍵。此外，細胞骨架[17]是細胞主要的力學信號傳導位點，可以直接將作用于細胞表面的應力傳導到細胞內各區(qū)。由此可以推測細胞骨架在針刺機械信號細胞內傳導過程中也可能發(fā)揮重要作用。本實驗中，針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 中間絲的表達高于空白組，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.203），而針刺組腧穴穴區(qū)局部組織CSK 微絲、微管的表達低于空白組，統(tǒng)計學意義顯著（P＜0.01），這說明中間絲的結構相對穩(wěn)固，不易受到外來因素的干擾，當毫針針刺時，中間絲沒有發(fā)生表達量的變化。微絲、微管由于本身是處于高動態(tài)平衡狀的細胞結構，在毫針針刺這一過程中，針刺機械力能使微絲、微管原有的動態(tài)平衡遭到打破，部分微絲解聚重構趨勢明顯，以適應來自針刺的機械外力刺激和傳導調整的信號。因此，細胞骨架中微絲、微管可能是細胞內傳遞針刺機械刺激的主要力學轉導途徑。

越來越多的證據(jù)顯示[18]，線粒體以細胞骨架蛋白為軌道而得以運動，細胞骨架通過各種非特異性的途徑調節(jié)線粒體的形態(tài)和功能；而線粒體是細胞內氧化磷酸化和合成ATP 的主要場所，為細胞的活動提供能量，是細胞生命活動的控制中心。本實驗中，針刺組腧穴穴區(qū)局部組織ATP 含量高于空白組，統(tǒng)計學意義顯著（P＜0.01），說明針刺可以提高腧穴能量代謝水平，可能激發(fā)針刺效應啟動。

另外，細胞骨架跨核膜聯(lián)系細胞核，可以調節(jié)基因表達。其中，PCNA 與細胞DNA 合成關系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞活力的特征性指標[19]。本次研究，針刺組腧穴穴區(qū)局部PCNA 陽性計數(shù)率均高于空白組，統(tǒng)計學意義顯著（P＜0.01），說明針刺可能可以調節(jié)腧穴穴區(qū)細胞核基因和蛋白表達水平，提高腧穴活力。

綜上所述，毫針針刺時腧穴筋膜組織成纖維細胞的細胞骨架中微絲和微管是主要的細胞內力學信息傳導通路；通過細胞骨架通路，腧穴組織能量代謝增強、腧穴細胞活力增加，這可能是毫針刺激腧穴，激發(fā)針刺治療作用啟動的現(xiàn)代醫(yī)學機理之一。雖然本次研究可能進一步揭示針刺作用原理提供了新的思路，但這也還需要更深入地研究進一步驗證。