甜橙SPL基因家族的鑒定及其在成花誘導中的表達分析

楊 杰，陳 蓉，胡文娟，吳巧玲，陳健美，李興濤

(贛南師范大學 生命科學學院，國家臍橙工程技術研究中心，江西贛州 341000)

SQUAMOSA promoter binding protein-like(SPL)蛋白又被稱為SQUAMOSA promoter binding protein(SBP)-box proteins，是廣泛存在于綠色植物中的一類轉錄因子，在植物胚胎發(fā)育、葉片生長、成花轉變、育性、赤霉素響應及脅迫應答等過程中起重要調控作用[1]。已發(fā)現(xiàn)的SPL/SBP家族成員都具有高度保守的SBP結構域，能識別并結合到SQUAMOSA(SQ-UA)啟動子上[2]。該結構域由76個氨基酸殘基組成，一般含2個鋅指結構域，即Cys-Cys-His-Cys(C2HC)和Cys-Cys-Cys-His(C3H)，以及1個保守核定位信號[3]。此外，部分SPL基因的表達還會受到miR156/miR157的調控[4]。

SPL基因家族是多基因家族，參與植物生長發(fā)育和逆境脅迫等過程[5]。目前，桃[2]、擬南芥[6]、水稻[7]、番茄[8]和草莓[9]等植物的SPL基因已被陸續(xù)鑒定。其中，Chao等[5]發(fā)現(xiàn)AtSPL1和AtSPL12的過量表達會增強擬南芥的耐熱性；過量表達AtSPL3和AtSPL9會使擬南芥提前開花[10]；AtSPL15在花誘導過程中通過激活花調節(jié)因子FRUITFULL(FUL)和 miR172b 來誘導擬南芥開花[11]；Wang等[12]發(fā)現(xiàn)AtSPL2可直接作用于ASYMMETRIC LEAVES2(AS2)來調控花器發(fā)育和植物育性；將水稻OsSPL16高表達，可提高其籽粒的質量和產(chǎn)量[13]。

甜橙(Citrussinensis)是柑橘中主要的鮮食品種，因其汁多味美、營養(yǎng)豐富受到消費者喜愛。但是中國甜橙品種單一，成熟期集中在11、12月份，造成鮮果集中上市，制約了鮮橙產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。‘贛南早’是國家臍橙工程技術研究中心選育的甜橙早花品種，是甜橙品種‘紐荷爾’的芽變系，果實熟期比‘紐荷爾’提前30 d以上[14]。本課題組經(jīng)過多年觀察發(fā)現(xiàn)，‘贛南早’比‘紐荷爾’提前10～15 d開花。研究發(fā)現(xiàn)，在果樹栽培過程開花期提早，果實可提早成熟[15-16]。SPL基因家族在植物花發(fā)育過程起重要調控作用，但至今其在甜橙成花誘導過程中的作用機制尚未被報道。本研究鑒定了CsSPL基因家族，分析其蛋白理化性質、染色體定位、基因結構等及其在甜橙不同組織的表達，并通過qRT-PCR對比分析甜橙不同花期品種成花過程中CsSPLs的相對表達水平，為探討CsSPLs在甜橙開花調控等方面的生物學功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甜橙早花品種‘贛南早’和對照品種‘紐荷爾’來自贛南師范大學國家臍橙工程技術研究中心，均是枳橙為砧木的8年生果樹。于2019年11月1日開始采集生長良好、長勢一致的甜橙品種短枝新梢(方向朝南)的花芽和葉片進行對比試驗，之后每隔30 d(5個成花時期)取樣一次，每次取3棵。經(jīng)液氮冷凍后置于-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 甜橙SPL基因鑒定甜橙基因組數(shù)據(jù)來自CPBD(http://citrus.hzau.edu.cn/)，SPL-family模型(PF03110)來自Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)。使用HMMER3.0軟件搜索CsSPLs，通過CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/term)和InterPro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)驗證序列保守結構域，去除SBP結構域不完整的基因，得到的CsSPLs按照其在染色體的位置依次進行命名。

1.2.2 甜橙SPL基因分析利用ExPASy在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/compute_pi/)和ProtComp9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)分析CsSPLs的等電點、分子量及亞細胞定位；采用在線軟件SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODLE(https://swissmodel.expasy.org/)分別預測分析CsSPLs的蛋白二級結構和三級結構；使用Map MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)在線繪制CsSPLs在染色體上的分布；使用GSDS v2.0(http://gsds.gao-lab.org/)繪制CsSPLs的基因結構圖；利用MEME(http://meme-suite.org/)分析CsSPLs編碼的蛋白保守基序，Motif數(shù)量設為10；在MEGA 6.0中使用鄰接法對甜橙和擬南芥的SPL蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建，bootstrapping為1 000；使用TBtools分析CsSPLs間的共線性；利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測CsSPLs啟動子區(qū)的順式作用元件；從CPBD下載甜橙不同組織的轉錄組數(shù)據(jù)，使用TBtools進行表達熱圖的繪制。

1.2.3 RNA提取和qRT-PCR檢測根據(jù)CsSPLs基因序列設計qRT-PCR引物(表1)，以柑橘ACTB作為內參基因，引物為CsACTB-F/CsACTB-R。使用植物總RNA提取試劑盒(Simgen，中國杭州)提取樣品總RNA，使用反轉錄試劑盒(Simgen，中國杭州)反轉錄合成cDNA。利用2×SYBR Green PCR Mix(Simgen，中國杭州)在Light-Cycler 480型實時熒光定量PCR儀(Roche，Basel，Switzerland)進行qRT-PCR操作，每個樣品3次技術重復。反應體系10 μL，其中，cDNA和ddH2O各2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green PCR Mix 5 μL。PCR程序：95 ℃ 60 s；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s；40 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法計算CsSPLs的表達水平，使用DPS數(shù)據(jù)處理軟件分析基因表達量間的差異顯著性，SigmaPlot 14.0軟件制圖。

表1 甜橙SPL基因的qRT-PCR引物信息

2 結果與分析

2.1 甜橙SPL基因鑒定及理化性質分析

從甜橙基因組鑒定出15個CsSPLs，根據(jù)染色體位置依次命名為CsSPL1～CsSPL15(表2)。CsSPL蛋白的CDS長度為394～3 229 bp，其中CsSPL3蛋白最短，CsSPL15蛋白最長；氨基酸數(shù)量為130～1 075 aa；等電點為5.99～9.28，其中CsSPL2、CsSPL7、CsSPL12和CsSPL14的等電點均小于7，為酸性蛋白，CsSPL11等電點是7，為中性蛋白，其余CsSPL蛋白均為堿性蛋白；CsSPL蛋白的分子量差異較大，最大CsSPL15為118.75 kD，最小CsSPL3為14.73 kD。亞細胞定位預測的結果顯示，僅CsSPL1、CsSPL6、CsSPL8和CsSPL9定位在細胞外，其余CsSPL蛋白均定位在細胞核。

表2 甜橙SPL蛋白理化性質

2.2 甜橙SPL蛋白的二級結構預測

甜橙SPL蛋白的二級結構預測結果表明(表3)，無規(guī)則卷曲是構成甜橙SPL蛋白二級結構的主要組成部分，所占比例在31.28%～72.03%之間，其次是α-螺旋和β-折疊，所占比例分別為11.11%～43.59%和5.56%～6.67%。

表3 甜橙SPL蛋白二級結構組成

2.3 甜橙SPL基因的染色體分布

15個CsSPLs不均勻地分布在甜橙6條染色體上(圖1)。其中，chrUn上分布最多，為4個CsSPLs；chr1和chr7次之，各有3個CsSPLs；chr2和chr9各有2個CsSPLs；chr5上最少，僅有1個CsSPLs。

2.4 甜橙SPL基因的結構和保守基序

CsSPLs的基因結構相對復雜(圖2)。內含子數(shù)為1～9個，其中CsSPL10、CsSPL11和CsSPL15的內含子數(shù)最多，為8～9個；CsSPL3、CsSPL4和CsSPL5內含子數(shù)最少，均為1個。外顯子數(shù)為2～9個；CsSPLs被劃分成8個亞族，同一亞族CsSPLs的基因結構較為相似，如CsSPL1、CsSPL8和CsSPL14同屬S9亞族，均含3個長度相似的外顯子，證明親緣關系近的CsSPLs具有較保守的基因結構。

CsSPLs的蛋白序列含有10個保守性較強的Motif(圖3)。除CsSPL5只含Motif 1和Motif 3外，其余CsSPLs均含有Motif 1、Motif 2和Motif 3。此外，CsSPL10、CsSPL12和CsSPL15還含有Motif 4～Motif 9；CsSPL2、CsSPL7、CsSPL9和CsSPL14都含有Motif 10。總體來看，同一亞族的CsSPLs具有相似的Motif分布。但是，個別亞族間不同的CsSPLs含有不同的Motif，如CsSPL3的Motif數(shù)量相比于同一亞族的其他基因有缺失，暗示同一亞族的CsSPLs有不同的調控功能。對10個Motif結構進行分析(表4)，發(fā)現(xiàn)Motif 4含有50個保守氨基酸，Motif 10保守氨基酸數(shù)最少，僅有11個。

表4 甜橙SPL蛋白保守序列

2.5 甜橙SPL基因的系統(tǒng)進化分析

構建擬南芥(17個)和甜橙(15個)SPL家族的系統(tǒng)進化樹(圖4)。結果顯示，整個進化樹被分為9個亞族(S1～S9)。除S2亞族之外，其余8個亞族均含CsSPLs。其中S3、S8和S9亞族均含3個CsSPLs，數(shù)量最多；其次是S6亞族，含2個CsSPLs；S1、S4、S5和S7亞族最少，各僅含1個CsSPLs。

2.6 甜橙SPL基因的共線性分析

為了確定甜橙SPL家族成員的復制事件，對甜橙基因組進行了共線性分析(圖5，A)。結果顯示，CsSPL6/CsSPL9和CsSPL8/CsSPL14存在共線性關系，分別位于chr5、chr7和chrUn上。為進一步闡明SPL基因在甜橙和雙子葉模式植物擬南芥間的進化關系，對2個物種進行了共線性分析。如圖5，B所示，在甜橙和擬南芥之間鑒定出CsSPL8/AtSPL13b、CsSPL11/AtSPL7、CsSPL14/AtSPL13a和CsSPL14/AtSPL13b共4個同源基因對，其中AtSPLs均位于擬南芥5號染色體上，CsSPLs分別位于chr7、chr9和chrUn上。此外，存在共線性關系的基因在進化分析中被劃在同一亞族。揭示這些基因的起源進化中發(fā)生了串聯(lián)重復，暗示它們的結構和功能存在相似性。

2.7 甜橙SPL基因的順式作用元件預測

預測CsSPLs上游2 000 bp啟動子序列上光響應元件、激素響應元件和逆境脅迫響應元件的分布情況(圖6)。其中，15個CsSPLs均存在光響應元件和激素響應元件，推測CsSPLs在甜橙響應光調控及體內激素平衡過程中發(fā)揮重要作用；除CsSPL2和CsSPL6外，其他13個CsSPLs均存在數(shù)量不一的逆境脅迫響應元件，揭示了CsSPLs在不同抗逆生境中起重要的調控作用。

2.8 甜橙SPL基因在其不同組織的表達分析

基于甜橙轉錄組數(shù)據(jù)分析CsSPLs在甜橙愈傷組織、花、葉片和果實中的表達情況，繪制CsSPLs的表達熱圖(圖7)。結果表明，CsSPLs在甜橙不同組織中的表達量存在較大差異。其中CsSPL3、CsSPL11、CsSPL12和CsSPL15在甜橙愈傷組織中優(yōu)勢表達；CsSPL3、CsSPL7、CsSPL8、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15在甜橙花中高表達；CsSPL4、CsSPL7、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15在甜橙葉片中高表達；甜橙果實中高表達的基因包括CsSPL3、CsSPL10、CsSPL12和CsSPL15。

2.9 甜橙SPL基因的表達特異性分析

選擇花和葉片中高表達基因CsSPL3、CsSPL4、CsSPL7、CsSPL8、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15，在甜橙早花品種‘贛南早’和對照品種‘紐荷爾’成花階段進行相對表達量檢測(圖8)。結果顯示，8個CsSPLs在兩甜橙品種的花芽和葉片中均有表達。各時期CsSPLs在花芽和葉片中的相對表達量表現(xiàn)為早花品種‘贛南早’均高于對照品種‘紐荷爾’。其中，在4時期和5時期，CsSPLs在兩甜橙品種的相對表達差異顯著，‘贛南早’比‘紐荷爾’上調數(shù)倍。這些結果證明，CsSPLs在甜橙成花發(fā)育和開花時期等過程中發(fā)揮調控作用。

3 討 論

SPL基因家族廣泛存在于植物中，且基因成員數(shù)量不會隨著基因組大小的變化而成比例變化[17]。本研究從甜橙基因組中鑒定得到15個CsSPLs，其數(shù)量較蘋果(27個)少，與番茄(15個)一致，比野草莓(14個)多[3,9]。15個CsSPLs的內含子-外顯子數(shù)量差異較大，40%的CsSPLs含有2個內含子和3個外顯子，最多的CsSPL15的內-外顯子數(shù)量均為9，而最少的CsSPL3僅含1個內含子和2個外顯子。該結果與前人在苦蕎[18]和小麥[19]中的研究結果相近。CsSPL12的基因結構不同于CsSPL10和CsSPL15，這可能是同一亞族不同基因在進化過程中出現(xiàn)了內含子的丟失或增加。此外，CsSPLs的氨基酸長度變化范圍較大，這可能與CsSPLs的功能多樣性有關。

Preston 等[20]根據(jù)進化關系將擬南芥SPL蛋白序列的進化樹構建為8個亞族。本研究中甜橙和擬南芥SPL蛋白序列聚類為9個亞族，其中AtSPLs同樣被劃分在除S4亞族之外的8個亞族，而CsSPLs被劃分在S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9亞族。CsSPL4和AtSPL3分別被劃分在2個亞族，需進一步研究其功能的互補性。另外，CsSPLs的啟動子區(qū)域包括大量與植物生長發(fā)育和逆境脅迫相關的順式作用元件，劉婷婷等[21]也發(fā)現(xiàn)蘿卜SPL基因家族成員啟動子上存在激素、低溫和干旱的響應元件，支持了本研究的分析結果。

目前已有許多研究證明SPL基因家族參與花的生長發(fā)育，在調控植物成花周期過程中發(fā)揮重要作用[22]。本研究分析了花和葉片中高表達CsSPLs在兩甜橙品種中的表達模式，發(fā)現(xiàn)各時期CsSPL3、CsSPL4、CsSPL7、CsSPL8、CsSPL12、CsSPL13、CsSPL14和CsSPL15均在早花品種‘贛南早’中優(yōu)勢表達；其中4和5時期，CsSPLs在兩甜橙品種花芽和葉片中的相對表達差異顯著增加。推測CsSPLs積極參與對甜橙開花周期的調控過程。本研究全面分析了甜橙SPL基因家族，發(fā)現(xiàn)CsSPLs響應甜橙花芽分化和開花過程，為解析CsSPLs調控開花周期的功能機制提供了基礎資料，以便在后續(xù)研究中進一步驗證。甜橙中參與成花的關鍵基因的挖掘為甜橙的早熟、鮮果非集中上市提供了新的途徑。