Calm1基因敲除小鼠腦蛋白質組學特點及臨床意義

李華欣 馬賓 劉曉芬 丁瑩梅 袁梅

(1南華大學附屬第二醫院神經內科，湖南 衡陽 421001；2南華大學衡陽醫學院)

鈣離子鈣信號在生命活動中承擔重要作用，鈣信號既是細胞外信使又是細胞內信使，在細胞中影響基因表達、細胞生長、發育、存活甚至死亡。而鈣調蛋白(CaM)是真核生物細胞中最主要、最普遍的鈣傳感器〔1〕和換能器，通過與鈣離子結合調節其他蛋白質的結構和功能從而充分發揮鈣離子的作用。在腦中，CaM主要與急性腦梗死〔2，3〕、阿爾茨海默病〔4〕、癲癇〔5，6〕和帕金森病〔7〕有關。前期研究主要集中在CaM與急性腦梗死關系及其機制〔8，9〕。2015年，本課題組研究發現急性腦梗死患者血漿CaM水平與正常對照組相比表達顯著增加〔9〕。而使用鈣調蛋白拮抗劑〔10，11〕抑制CaM表達可以減輕急性腦梗死后腦損傷。在人體，CaM 由3個非等位基因CALM1、CALM2、CALM3編碼〔12〕，都編碼產生CaM，其中研究最普遍和廣泛的基因是CALM1(小鼠的同源基因是Calm1)。為進一步探索CaM在缺血性腦卒中的作用，本文構建了Calm1基因敲除小鼠模型。 蛋白質組學作為一種高通量篩選方法，近來在神經系統疾病相關研究〔13，14〕中越來越受到關注。蛋白質是細胞功能的最主要執行者，細胞中異常表達的蛋白質或蛋白質修飾改變可能引發一系列疾病。本研究采用TMT標記的定量蛋白組學技術，全面檢測野生型(WT)、純和型(HO)、雜合型(HE)小鼠腦組織蛋白質表達譜，結合生物信息學GO、KEGG和STRING分析來探究差異蛋白涉及的功能及參與的信號通路，以期從宏觀角度上發現Calm1表達改變涉及的差異蛋白標靶，為探究Calm1表達改變對腦組織功能影響及其作用機制提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 C57BL/6J小鼠由上海南方模式生物科技有限公司提供，為Calm1-eKO1基因敲除小鼠模型，交配后獲得WT(+/+)、HE(+/-)和HO(-/-)小鼠。實驗動物合格證編號：20170010002299。實驗小鼠被飼養于南華大學實驗動物學部進行繁殖育種和實驗，喂食大小鼠維持飼料和繁殖飼料。經PCR產物大小方案鑒定小鼠基因型。對實驗動物的處理及動物實驗的開展均符合動物倫理學標準，并經南華大學醫學倫理委員會(編號：2018-02-0002)審查通過。3種基因型小鼠各3只，鼠齡3.0～4.1 w，平均3.5 w，分為WT組、HE組和HO組。PCR實驗采用引物序列為P1：5′-TGAAACCTGGATTGGTAACCCA-3′；P2：5′-CATCACGACACTTAATGGCGC-3′；P3：5′-GACGGCACCATCACAACCAA-3′。

1.2標本采集及運輸 小鼠禁食12 h，自由飲水。經5%水合氯醛腹腔注射將小鼠麻醉后固定在橡皮膠墊上，先用眼科剪剪開小鼠胸腔暴露心臟，再使用寬頭無齒鑷子小心夾持固定心臟，最后將1 ml注射器針頭插入左心室，緩慢注射4℃無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注，灌至肝臟變成純桃黃色。小鼠斷頭取完整腦組織，4℃無菌PBS輕輕沖洗，濾紙吸干表面水分，置于液氮速凍保存，干冰運輸。所有小鼠腦組織標本在質譜檢測前避免反復凍融。

1.3主要試劑與儀器 麻醉藥水合氯醛購于上海麥克林公司；二硫鍵還原劑TCEP〔tris(2-carboxyethyl) phosphine〕、烷基化劑IAA(iodoacetamide)、用于蛋白重溶的100 mmol/L HEPES和SDC(sodium deoxycholate)、用于TMT標記的Hydroxylamine、Anhydrous acetonitrilel均購于美國 Sigma-Aldrich公司；用于配制RIPA裂解液的試劑購于上海生工生物公司、美國Sigma-Aldrich公司；測序級胰蛋白酶購于美國Promega公司；TMT標記試劑TMT10-plex Isobaric Label Reagent Set購于美國Thermo Fisher Scientific公司；蛋白酶抑制劑購于上海數譜生物公司；用于質譜分析的試劑購于美國 Sigma-Aldrich公司、美國J.T.Baker公司；其余試劑至少為國產分析純試劑級別。Q Exactive質譜儀、1200液相色譜系統、混勻器均購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4蛋白提取 取小鼠全腦組織，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿使充分裂解，注意冰上操作。提取蛋白后，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定每份腦組織蛋白濃度。取96孔板，每孔加入標準蛋白或待測樣品20 μl，工作液160 μl，37℃搖床震蕩孵育30 min，酶標儀檢測562 nm波長處的光密度(OD)值。繪制標準蛋白曲線(R2>0.95)并根據標準曲線計算相應樣品的濃度和蛋白總量。聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣20 μg，考馬斯亮藍染色檢測蛋白質量。

取上述樣品加用裂解液稀釋至蛋白濃度為1 mg/ml。再加入TCEP在55℃條件下孵育10 min還原二硫鍵。采用IAA避光反應15 min，烷基化TCEP還原的二硫鍵。加入4～6 倍體積預冷的丙酮充分混勻，沉淀蛋白。4℃條件下10 000 r/min離心10 min，棄上清。加入200 μl預冷的80%丙酮洗滌沉淀，重復2次后收集沉淀。按次序先后加入含1% SDC 的100 mmol/L HEPES、再懸浮緩沖液、2 μg trypsin溶液分別反應，簡單離心后37℃震蕩孵育過夜使蛋白充分溶解。再高速離心10 min，留取上清至新EP管中。

1.5TMT標記 取出TMT標記試劑平衡至室溫。每管試劑中加入41 μl無水乙腈(ACN)溶解并離心，吸取20 μl TMT 溶液至待測樣品中，混勻后離心，室溫孵育1 h，加入羥氨室溫再孵育15 min終止反應。各待測樣品等量混合。加入TFA沉淀SDC，提取共沉淀的多肽，重復2次，最終得到的上清即為標記的多肽樣品。使用C18脫鹽柱給多肽樣品脫鹽，真空干燥，-80℃ 凍存或加入0.1% FA，H2O，2% CAN配成的緩沖液重溶至濃度為1 μg/μl的多肽溶液。取100 μg多肽樣品，經HPLC反向柱層析系統(流動A相：10 mmol/L甲酸銨水溶液，pH=10；流動B相：10 mmol/L甲酸銨，10% H2O，90% ACN，pH=10)梯度洗脫，然后經XBridge BEH C18 XP Column(150 mm×2.1 mm)分離，每30 s收集一個組分，收集 120份，隨后合并為12 個組分，再經真空干燥后-80℃凍存。

1.6液相色譜-串聯質譜聯用分析(LC-MS/MS) 每個組分取2 μg多肽經nano-UPLC 液相系統EASY-nLC1200 以300 nl/min恒定流速進行分離。分析采用100 μm ID × 15 cm 反相色譜柱(Reprosil-Pur 120 C18-AQ，1.9 um，Dr.Math)。流動相A 液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為2%)，B 液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為80%)。色譜柱以100%A 液平衡。液相梯度設置：流動相B：8%～35%持續70 min，35%～45% 持續12 min，45%～100% 持續2 min，100%持續2 min，2%持續2 min。

分離后的肽段連用Q-Exactive 質譜儀(Thermo Finnigan) 在線進行質譜分析。分析時長：120 min/sample，正離子檢測模式，母離子掃描范圍350～1 600 m/z。數據采集模式使用數據依賴型掃描(DDA)程序。每次全掃描后采集20個碎片圖譜(MS2 scan，HCD)。MS1在200 m/z時分辨率為70 000，MS2在200 m/z時分辨率為35 000；MS1 AGC為3E+6，MS2 AGC 為1E+5，最大離子注入時間(Max IT)：MS1，50 ms；MS2，45 ms。標準化碰撞能量(NCE) 為32%，隔離窗口為2 m/z，動態排除時間30 s。

1.7MaxQuant搜庫和TMT定量 LC-MS/MS原始數據使用MaxQuant 1.6.1.0進行搜庫和定量分析。蛋白數據庫為：uniprot-mouse-20200526.fasta；定量方式為二級報告子定量，16標TMT，標記位點為多肽N末端和Lys(K)，PIF設為0.75。特異性酶為trypsin/P，最大漏切數2；可變修飾有Oxidation(M)，Acetyl(protein N-term)，固定修飾 Carbamidomethyl(C)；最小多肽長度為7，最大多肽分子量4 600 Da；多肽和蛋白水平FDR均控制在0.01；用于定量的多肽包括Unique，可變修飾的多肽不用于定量；同時進行iBAQ非標定量。

隨后對9個樣品進行標準化：性質相似的生物樣品中絕大部分蛋白表達水平應該是不變的，只有少數蛋白會出現差異表達；根據這個原理，將各組樣品標準化，使各組樣品總蛋白或中位數一致。

1.8統計檢驗和生物信息學分析 隨后對標準化后的定量結果進行統計學分析，得到對應的差異表達蛋白。本實驗含3個生物學重復，將差異倍數(FC)>1.2或FC<1/1.2，P<0.05，單肽≥2的蛋白定義為差異顯著，并進行后續GO、KEGG通路、蛋白相互作用分析和展示。

2 結 果

2.1小鼠基因型鑒定 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖像顯示：WT小鼠擴增出DNA片段約為818 bp；Calm1基因敲除HO小鼠擴增出DNA片段約為979 bp；Calm1基因敲除HE小鼠擴增出DNA片段約為979 bp+818 bp，見圖1。

圖1 PCR擴增產物凝膠電泳圖像

2.2總蛋白及DEPs鑒定和篩選 本實驗多肽和蛋白水平錯誤發現率(FDR)均控制在0.01，多肽總數22 387個，蛋白質總數4 595個，可定量蛋白數4 529個。C-A組中，顯著上調蛋白23個，顯著下調蛋白31個，共54個差異蛋白質(DEPs)；C-B組中，顯著上調蛋白19個，顯著下調蛋白16個，共35個DEPs；C-A組、C-B組取交集，只有一個交集蛋白質：Sorbs3；C-A組DEPs火山圖上調最顯著的5個蛋白質是Ctif、Gpr17、Hsph1、Ttn、Ugt8a，下調最顯著的為 S100a5、Cirbp、Nqo1、Gng10、Ass1。C-B組上調最顯著的5個蛋白質是Ahnak2、Sorbs3、Fam81a、Timm9、Col1a1，下調最顯著的為 Cox7a2、Cox5a、Cox6c、Cox6b1、Cdk13。見圖2。

2.3KEGG 通路分析 KEGG通路富集分析結果顯示，C-A組54個DEPs富集在11條通路中，C-A組上調的23個DEPs富集在20條通路中，C-A組下調的31個DEPs富集在16條通路中。

C-B組的35個DEPs富集在18條通路中，C-B組上調的19個DEPs富集2條通路中，C-B組下調的16個DEPs富集在16條通路中，見圖3。

圖2 DEPs火山圖

圖3 KEGG通路富集分析結果

2.4GO富集分析 GO富集分析結果顯示，C-A組54個DEPs富集在生物學過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)分別有32、22、27條，其中，C-A組上調的23個DEPs富集在BP、CC、MF分別為12、7、39條，C-A組下調的31個DEPs富集在BP、CC、MF有37、29、39條。

C-B組35個DEPs富集在BP、CC、MF分別有134、86、47條，其中，C-B組上調的19個DEPs富集在BP、CC、MF分別有175、52、32條，C-B組下調的16個DEPs富集在BP、CC、MF各共有104、56、43條，見圖4。

圖4 GO富集分析結果

2.5蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 PPI網絡采用STRING數據庫進行構建，隱藏無連接節點的基因進行展示。然后將STRING 產生的蛋白相互作用參數導入Cytoscape(版本：3.8.2；https：//cytoscape.org/)，利用CytoHuabba插件，再采用最大集團中心度(MCC) 算法篩選排名前10的關鍵基因。C-A組27個DEPs相互作用如圖5A所示，前10的關鍵基因按中心度依次排列為Hsp90ab1、Hsp90aa1、Nqo1、Ephx1、Gstm5、Gstm1、Tomm34、Hsph1、Calm1和Acss2，顯示如圖5B。C-B組20個DEPs相互作用如圖6A所示，前10的關鍵基因按中心度依次排列為Cox4i1、Cox7a2、Cox5b(Gm11273)、Cox6b1、Cox5a、Cox6c、Cox7c、Sod1、Nefh和Nefl，顯示如圖6B。

A：隱藏無連接節點后，27個DEPs的相互作用；B：使用Cytoscape作圖軟件中CytoHubba插件按中心度篩選出來的10個關鍵基因；紅色表示連接度高，黃色表示連接度低；橢圓節點表示上調，菱形節點表示下調圖5 C-A組DEPs相互作用分析

A：隱藏無連接節點后，20個DEPs的相互作用；B：使用Cytoscape作圖軟件中CytoHubba插件按中心度篩選出來的10個關鍵基因；紅色表示連接度高，黃色表示連接度低；橢圓節點表示上調，菱形節點表示下調圖6 C-B組DEPs相互作用分析

2.6重要DEPs的表達量聚類分析 根據C-A、C-B兩組上調、下調最顯著的10個DEPs，C-A、C-B兩組連接度最高的10個關鍵蛋白質。對C-A、C-B兩組篩選出來的上述DEPs聚類后制作熱圖，見圖7。

圖7 差異蛋白質聚類分析

3 討 論

本研究發現，Calm1敲除后，涉及的DEPs主要在神經退行性疾病中發揮了作用。C-A、C-B兩組中涉及的通路主要包括多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse，Calm1/Gng10/Th，下調)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Cox6b1，下調)、肌萎縮性側索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Nefl/Nefm/Sod1/Cox6b1/Nefh，下調)、帕金森病(Parkinson disease，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Cox6b1，下調)、亨廷頓病(Huntington disease，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Sod1/Cox6b1，下調)、多種神經退行性疾病(Pathways of neurodegeneration-multiple diseases，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Nefl/Nefm/Sod1/Cox6b1/Nefh，上調下調均有)、朊病毒病(Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Sod1/Cox6b1，下調)。朊病毒病是一種具有高度傳染性的神經退行性疾病，能夠通過引起特定蛋白質的錯誤折疊、聚集和沉淀，從而引起肌萎縮性側索硬化癥的漸進性加重〔15，16〕。上述通路中DEPs主要包括細胞色素C氧化酶多種亞基(Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Cox6b1)，與阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化癥、帕金森病和亨廷頓病通路均有關聯；包括神經絲輕、中、重多肽(Nefl/Nefm/Nefh)，其中，Nefh與軸突成熟有關且通常用作神經元損傷的生物標志物，與肌萎縮側索硬化有關；包括超氧化物歧化酶〔Cu-Zn〕(Sod1)，該基因的突變被認為是肌萎縮側索硬化的原因〔17，18〕，還與亨廷頓病有關。

CaM通過直接參與β淀粉樣蛋白質的產生、神經元纖維纏結的形成及調控下游的CaM結合蛋白與阿爾茨海默病有密切聯系〔4〕；CaM調控多種鈣離子通道，參與維持細胞內鈣離子穩態，CaM的高表達或活性增強也可能導致CaM結合蛋白的過度激活而對細胞產生毒害作用，有實驗表明抑制CaM結合蛋白的表達在帕金森病動物模型和患者中都帶來了有益影響〔7〕；2016年，研究人員采用蛋白質組學分析方法探究肌萎縮側索硬化患者的發病機制，也發現患者脊髓組織神經元胞體和樹突中CaM的表達普遍降低〔19〕，這可能是破壞了鈣穩態；CaM與亨廷頓病〔20，21〕有關聯，CaM片段的表達(由CaM的76～121位氨基酸組成)降低了CaM與突變的亨廷頓蛋白、轉谷氨酰胺酶修飾的亨廷頓蛋白的結合及與突變體亨廷頓蛋白相關的細胞毒性和標準化的細胞內鈣釋放，CaM片段的表達改善了亨廷頓病R6/2小鼠模型的運動功能；細胞色素C氧化酶相關蛋白參與構成線粒體有氧呼吸復合體Ⅳ，與線粒體功能的正常發揮密切相關；已有證據表明線粒體特別是突觸前神經元中的線粒體功能障礙是神經退行性疾病的重要原因〔22，23〕，敲除Calm1，CaM表達降低可能通過下調細胞色素C氧化酶相關蛋白的表達從而引起Calm1敲除小鼠的神經退行性疾病發生和發展，具體是否有關聯還有待進一步驗證。CaM表達水平增高或活性增強，敲除Calm1使得CaM表達減低都有可能引起神經退行性疾病，但總的來說，抑制CaM的表達能夠一定程度改善神經退行性疾病患者的預后，但其明確的抑制程度也有待進一步研究。

研究發現，敲除Calm1，CaM表達降低，除與神經退行性疾病有關外，還可能通過調控乙醚脂質代謝通路(Ether lipid metabolism，Pld3/Ugt8a，上調)從而參與癌癥〔24〕。通過壞死性凋亡通路(Necroptosis，Hsp90ab1/Hsp90aa1，上調)從而參與神經發育〔25〕，參與阿爾茨海默病、帕金森病、多發性硬化等神經退行性疾病有關，還參與癌癥〔26〕。既往文獻對Calm基因突變(CaM表達降低)的研究主要與臨床上危及生命的惡性心律失常有關〔27，28〕，包括兒茶酚胺能多形性室性心動過速〔29〕、長QT綜合征(LQTs)〔30〕、特發性心室顫動(IVF)〔31〕；此外，研究人員于2019年還發現Calm基因突變(CaM表達降低)與神經系統病變有關〔28〕，包括癲癇發作、神經發育遲緩、運動和(或)認知功能障礙，但并未描述引起神經系統病變的相關機制。2018年，研究人員通過CRISPR Cas9技術置換Calm1中77處的甲硫氨酸編碼堿基，發現這種基因編輯的小鼠純合子在包括莫里斯水迷宮和聯想學習的學習測試中的表現與WT小鼠相比，并沒有統計學意義上的改變〔32〕。這些發現說明，CaM不僅在神經系統研究中很有意義，在惡性心律失常、許多癌癥的防治中也有重要意義，還需更深入的聯合研究。

既往Calm基因相關研究對象多為患者血清樣本或已發表文獻，采用全外顯子組測序(WES)、靶向二代測序(NGS)或Sanger測序方法研究基因之間的相互關系及對生物體的影響〔27，28〕。本研究應用最新的TMT標記定量蛋白組學方法，方法上較基因組學篩查方法在基因的功能及其調控機制研究上更為全面和可靠。同時，研究對象為基于CRISPR/Cas9基因組編輯技術構建和培育的Calm1穩定敲除HO、HE和WT小鼠，在模型上具有原始創新性。本研究首次揭示了Calm1敲除后小鼠腦組織的蛋白組學變化特征，初步提示了DEPs涉及的生物學功能及信號通路。Calm1敲除后顯著改變腦組織中蛋白質表達特征并影響多條與神經退行性疾病關系密切的信號通路，表明CaM異常表達在神經系統疾病的發病中起到重要作用。