GAS5靶向miR-128調控帕金森病模型細胞凋亡的分子機制

歐詒丹 高元杰 陳靜 (儋州市人民醫院神經內科，海南 儋州 571700)

帕金森病(PD)在60歲以上人群發病率約1%〔1〕，是以運動遲緩、僵硬、姿勢不穩和震顫為特征的神經退行性疾病〔2〕。建立PD模型細胞可研究PD發展的分子機制，為其治療提供分子靶點。

研究表明，miRNA參與PD相關基因的表達調控，長鏈非編碼RNA(LncRNA)參與PD的發病過程，miRNA和lncRNA可能是PD的潛在治療靶點〔3〕。生長抑制特異性轉錄本(GAS)5在癌癥中廣泛存在，可抑制多種腫瘤的發生發展〔4〕。但目前GAS5對PD的影響還不清楚，需要進一步研究。本研究通過生物信息學預測發現，miR-128可能是GAS5的靶基因。研究發現miR-128在PD中起重要的作用，敲低miR-128表達小鼠可出現運動障礙表現〔5〕。本研究通過以1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(MPP+)處理SK-N-SH細胞24 h的方式建立PD細胞模型，檢測GAS5和miR-128對PD模型細胞活性和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人神經母細胞瘤細胞SK-N-SH購自ATCC；DMEM高糖培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，MPP+、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司；B淋巴細胞瘤(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體和抗GAPDH抗體購自上海碧云天生物科技有限公司；Real-time PCR 試劑盒、反轉錄(RT)-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；總RNA提取試劑TRIzol和Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；引物、GAS5過表達載體(pcDNA3.1-GAS5)、GAS5干擾物(si-GAS5)、miR-128模擬物(miR-128)、miR-128抑制劑(anti-miR-128)、陰性對照(miR-NC、si-NC、anti-miR-NC和pcDNA)、GAS5的野生型和突變型雙熒光素酶載體購自上海吉瑪基因；流式細胞儀購自美國BD公司，光學顯微鏡、全自動酶標儀、發光儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將SK-N-SH細胞培養在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養基中，置于5% CO2、37℃培養箱中常規培養。待細胞生長融合成單層時，用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2PD細胞模型建立〔6〕取對數生長期的SK-N-SH細胞進行模型建立。分為對照(Con)組：SK-N-SH細胞正常培養；MPP+組：培養液中加入終濃度為2.50 mmol/L的MPP+，繼續培養24 h。MPP++轉染組：加入終濃度為2.50 mmol/L的MPP+培養24 h后進行細胞轉染。

1.2.3細胞轉染 將加入MPP+后培養24 h的SK-N-SH細胞，稀釋為1×106個細胞/ml，以每孔200 μl(2×105個/孔)接種于6孔板中，待細胞生長融合成單層時按照Lipofectamine2000說明書進行轉染。轉染分組：GAS5抑制組(轉染si-NC和si-GAS5)，miR-128過表達組(轉染miR-NC和miR-128)，GAS5過表達組(轉染pcDNA3.1和pcDNA3.1-GAS5)，GAS5和miR-128共抑制組(轉染si-GAS5+anti-miR-NC和si-GAS5+anti-miR-128)，GAS5野生型和突變型雙熒光素酶報告系統(轉染miR-NC+WT-GAS5、miR-128+WT-GAS5、miR-NC+MUT-GAS5和miR-128+MUT-GAS5)，將各載體或片段轉入MPP+處理24 h的SK-N-SH細胞中，轉染48 h，收集細胞，進行后續實驗。

1.2.4Real-time PCR檢測RNA的表達 收集MPP+處理和(或)轉染后的各組SK-N-SH細胞，用TRIzol試劑提取細胞總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板按照 Real-time PCR的說明書進行反應合成miR-128 和GAS5，反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，40個循環；72℃ 5 min。用2-ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.5MTT法檢測細胞活性 收集MPP+處理和(或)轉染后的各組細胞，稀釋后以2×103個細胞/孔接種于96孔板，在培養至24 h、48 h和72 h時進行MTT實驗，酶標儀檢測每孔細胞的OD490 nm(A)值。

1.2.6流式細胞術測定細胞凋亡率 收集MPP+處理和(或)轉染后的各組細胞，以每孔2×104個細胞接種于6孔板中培養48 h，棄去培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，按照流式法細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7Western印跡檢測蛋白表達 收集MPP+處理和(或)轉染后的各組細胞，冰浴超聲破碎細胞，離心收集蛋白，將蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后將蛋白條帶轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(Bcl-2抗體1∶2 000、Bax抗體1∶1 000和GAPDH抗體1∶3 000)，4℃過夜孵育，PBST洗膜2次，加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育1 h，顯影，以GAPDH 為內參照，分析蛋白表達水平。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1MPP+處理對SK-N-SH細胞的影響 與Con組相比，MPP+組處理的SK-N-SH細胞凋亡率顯著升高，細胞中Bax表達顯著升高，Bcl-2表達顯著降低，細胞在24 h、48 h和72 h的OD值均顯著降低(均P<0.001)，見圖1、表1、圖2。

圖1 MPP+處理對SK-N-SH細胞凋亡的影響

表1 MPP+處理對SK-N-SH細胞的影響

圖2 MPP+處理對SK-N-SH細胞凋亡蛋白表達的影響

2.2GAS5、miR-128在MPP+處理的SK-N-SH細胞中的表達 與Con組相比，MPP+組處理的SK-N-SH細胞中GAS5含量顯著升高，miR-128含量顯著下降(均P<0.001)，見表2。

2.3抑制GAS5對細胞MPP+處理的SK-N-SH細胞活性及凋亡的影響 與MPP++si-NC組相比，MPP++si-GAS5組SK-N-SH細胞中GAS5和Bax表達顯著下降，Bcl-2表達顯著升高，細胞凋亡率顯著下降，細胞OD值在24 h、48 h和72 h均顯著升高(均P<0.001)，見表3、圖3、圖4。

表2 GAS5、miR-128在MPP+處理的SK-N-SH細胞中的表達

表3 抑制GAS5對細胞MPP+處理的SK-N-SH細胞活性及凋亡的影響

圖3 抑制GAS5對細胞MPP+處理的SK-N-SH 凋亡的影響

1，2：MMP+-si-NC組,MMP+-si-GAS5組圖4 抑制GAS5對細胞MPP+處理的SK-N-SH 凋亡蛋白表達的影響

2.4GAS5靶向調控miR-128的表達 miR-128的中含有與GAS5互補的序列，見圖5。與miR-NC組相比，過表達miR-128組野生型WT-GAS5的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)；而突變型MUT-GAS5的熒光素酶相對活性無顯著變化。見表4。qRT-PCR結果表明，與pcDNA3.1組(1.01±0.10)相比，過表達GAS5可使miR-128含量顯著下調(0.31±0.03，P<0.05)；與si-NC組(1.03±0.10)相比，抑制GAS5表達可上調miR-128含量(1.62±0.16，P<0.05)。

圖5 GAS5靶向miR-128

2.5過表達miR-128對MPP+處理的SK-N-SH細胞活性及凋亡的影響 與MPP++miR-NC組相比，MPP++miR-128組SK-N-SH細胞中miR-128和Bcl-2含量顯著升高，Bax表達顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低，細胞OD值在24 h、48 h和72 h均顯著升高(均P<0.001)，見圖6、圖7、表5。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖6 過表達miR-128對MPP+處理的SK-N-SH凋亡的影響

1，2：MMP+-miR-NC組，MMP++miR-128組圖7 過表達miR-128對MPP+處理的SK-N-SH凋亡蛋白表達的影響

2.6抑制miR-128能逆轉抑制GAS5對細胞MPP+處理的SK-N-SH細胞活性及凋亡的作用 與MPP++si-GAS5+anti-miR-NC組相比，MPP++si-GAS5+anti-miR-128組SK-N-SH細胞中GAS5和Bax蛋白表達顯著升高(均P<0.001)，miR-128和Bcl-2蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，細胞OD值在24 h、48 h和72 h均顯著降低(均P<0.001)，見表6、圖8、圖9。

表5 過表達miR-128對MPP+處理的SK-N-SH細胞活性及凋亡的影響

表6 抑制miR-128能逆轉抑制GAS5對細胞MPP+處理的SK-N-SH細胞活性及凋亡的影響

圖8 抑制miR-128能逆轉抑制GAS5對細胞MPP+處理的SK-N-SH凋亡的影響

1，2：MPP++si-GAS5+anti-miR-NC組,MPP++si-GAS5+anti-miR-128組圖9 抑制miR-128能逆轉抑制GAS5對細胞MPP+處理的SK-N-SH凋亡蛋白表達的影響

3 討 論

PD影響著0.1%～0.2%的人類，是一種多因素導致的神經退行性疾病，導致運動功能減退，影響患者正常生活，且大多在神經元完全退化后期才被發現，缺乏早期診斷技術和后期治療策略，發現其早期診斷標志物和后期治療靶點是疾病研究的熱點〔7〕。

越來越多的研究表明，lncRNA參與中樞神經系統基因表達調控不同的分子機制，調控從染色質重塑為主的神經干細胞分化到神經元活動，通過驅動不同的調控機制觸發退行性神經死亡和病變〔7〕。LncRNA GAS5是GAS5，其通過調控細胞增殖、凋亡、細胞周期等生命過程，與心肌梗死、腦卒中、高血壓等多種疾病的發生、發展及治療密切相關〔8〕，其在癌癥中多異常表達，過表達GAS5可抑制多種腫瘤的發生發展〔9〕。但GAS5在神經系統疾病中的研究較少。最新研究表明，在大鼠嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞中，高表達GAS5能促進PC12細胞向Tuj1陽性神經元樣細胞分化，顯著抑制PC12細胞增殖和細胞周期，不影響PC12細胞的凋亡，提高膽堿乙酰轉移酶的表達，促進膽堿的釋放，GAS5可能有利于神經元和膽堿能神經系統的恢復〔10〕。GAS5在PD中的表達尚不清楚。本研究發現，GAS5在MPP+處理的SK-N-SH細胞(PD模型)中含量顯著升高，MPP+可促進SK-N-SH細胞凋亡并抑制細胞活性，抑制GAS5可提高MPP+處理的SK-N-SH細胞活性并抑制細胞凋亡。說明，GAS可能在PD的發展過程中發揮重要作用。

本研究通過TargetScan預測發現，miR-128 中含有與GAS5互補的序列，miR-128可能是GAS5的靶基因。miR-128在成年神經元中通過調節神經元信號網絡和興奮性來調節運動行為。在小鼠中，出生后神經元miR-128表達的減少可導致運動活動增加和致命的癲癇，miR-128的過度表達減弱了神經元的反應性，抑制了小鼠的運動活動，減輕了與PD和癲癇發作相關的運動異常〔11〕。在PD小鼠中，miR-128表達降低，其靶向負調控軸抑制蛋白(AXIN)1，高表達miR-128可抑制多巴胺神經元的凋亡并促進興奮性氨基酸轉運體(EAAT)4的表達〔12〕。本研究發現，miR-128在MPP+處理的SK-N-SH細胞(PD模型)中含量顯著下降，高表達miR-128可提高MPP+處理的SK-N-SH細胞活性并抑制細胞凋亡，與上述結論〔12〕類似。雙熒光素酶報告系統和qRT-PCR結果表明，GAS5靶向負調控miR-128的表達，抑制miR-128逆轉了抑制GAS5對MPP+處理的SK-N-SH細胞活性和凋亡的影響，驗證了最初的預測，在PD模型細胞中GAS5與miR-128之間具有調控關系。

綜上，在MPP+處理的PD模型細胞SK-N-SH中，lncRNA GAS5通過靶向miR-128調控PD模型細胞活性和凋亡，提示GAS5和miR-128是可能PD治療的潛在分子靶點。