依帕列凈調節糖尿病相關非編碼RNA表達機制

上官同琴 (鄭州市第九人民醫院，河南 鄭州 450000)

2型糖尿病(T2DM)約占所有糖尿病患者的90%，其胰島素產生能力并未完全喪失但胰島素受體卻有明顯減少。T2DM治療除了胰島素外主要還包括雙胍類、噻唑烷二酮類、磺脲類、α糖苷酶抑制劑等藥物，但這些藥物均有增加體重同時提高心血管疾病的潛在風險〔1，2〕。轉運蛋白在調節葡萄糖穩態中起重要作用，因為它們是葡萄糖通過細胞膜時的載體與通道。在哺乳動物中，有兩類葡萄糖轉運蛋白，它們屬于溶質載體(SLC)基因序列，包含50多個轉運蛋白家族。促進型葡萄糖擴散系統轉運蛋白(GLUT1)-4和GLUT6-12由SLC2家族編碼，而鈉-葡萄糖協同轉運蛋白(SGLT)1～5由SLC5家族編碼。

SGLT2 負責過濾后的葡萄糖在腎臟中的大量重吸收。SGLT2抑制劑是一類新型T2DM降糖藥物，其通過抑制腎臟對血糖重吸收來增加尿糖濃度〔3〕。依帕列凈是這類抑制劑中最有效的一種藥物，被廣泛用于治療T2DM〔4〕，其主要作用機制為通過抑制近端小管上的SGLT2蛋白來抑制腎臟對葡萄糖的重吸收，使得尿糖增加、血糖降低達到治療糖尿病的目的〔5，7〕。之前的研究都較多集中于對依帕列凈臨床安全性、藥理作用、藥動學等方面的研究〔8，9〕，而分子機制尤其非編碼RNA方向的研究則鮮有報道。本研究對依帕列凈引起組織非編碼RNA表達差異進行研究，初步闡述其導致差異表達的相關機制，為其研究提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 TRIZOL(Invitrogen，美國, 15596-026)，反轉錄試劑盒 (Thermo Fisher Scientific，美國, K1621)、熒光定量PCR 試劑盒 ( TAKARA，日本，RR014A), SGLT2 一 抗(abcam，美國，ab85626)、 NF-κB一抗(abcam，美國，ab16502)、GAPDH 一抗(abcam，美國，ab8245)、山羊抗兔二抗(abcam, 美國，ab6721)。

1.2方法

1.2.1小鼠給藥 選取6周齡的T2DM STZ模型小鼠6只，分成對照組(3只)和依帕列凈組(3只)。依帕列凈組小鼠通過飲食給藥法，按照每天300 mg/kg給與依帕列凈治療，連續給藥12 w。對照組小鼠給予相同飲食，但不含依帕列凈。按時對小鼠血糖和體重進行檢測及記錄，檢測時剪去小鼠尾巴端部約1 mm，待有血滴滲出后滴加于血糖檢測儀器上，同時記錄。

1.2.2Western印跡檢測 Western印跡檢測兩組SGLT2、NF-κB蛋白表達。將小鼠處死后分別取出腎臟及胰腺，加入800 μl RIPA 冰浴研磨裂解30 min，4℃溫度下12 000 r/min離心30 min后去除沉淀。測定濃度后取30 μg加入4×上樣緩沖液及RIPA配制20 μl體積，100℃煮沸5 min后冷卻上樣，進行聚丙酰胺凝膠電泳，80 V電泳120 min后濕法70 V轉膜100 min。5%脫脂奶粉封閉1 h后，一抗孵育過夜，第2天PBST清洗后加入二抗室溫孵育1 h后滴加顯色液曝光。

1.2.3qRT-PCR 將小鼠處死后分別取出腎臟及胰腺，用1 ml TRIZOL研磨裂解后提冰上靜置5 min，加入200 μl三氯甲烷，12 000 r/min 4℃離心15 min取上清加入等體積異丙醇，冰浴靜置30 min后4℃溫度下12 000 r/min離心30 min，用75%乙醇洗滌沉淀2次并用無RNA酶的水溶解。測定濃度后取500 ng總進行RT-PCR，并用所得cDNA經行Q-PCR并進行分析,內參為β-actin。miR-370的Q-PCR中，直接取用2 ng總RNA進行發轉，后用miR-370特異探針進行Q-PCR檢測，內參為U6。

1.2.4靶向SGLT2的mRNA序列 通過生物信息學軟件預測分析(www.mirbase.org)可能靶向SGLT2(official symbol：SLC5A2)的mRNA序列及其結合區域。連續給藥12 w的小鼠犧牲后，取腎臟提取總RNA。Q-RT-PCR檢測靶向SGLT2 mRNA的miRNA及糖代謝相關LncRNA的表達量。

1.3統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行雙尾t檢驗。

2 結 果

2.1依帕列凈可抑制SGLT2表達并降低T2DM模型小鼠血糖水平 與對照組相比較，依帕列凈組腎臟中SGLT2的蛋白及mRNA水平明顯降低(P<0.05)。依帕列凈組血糖含量明顯低于對照組(P<0.01)。依帕列凈組體重相比于對照組也有降低,但差異無統計學意義。見圖1、表1、表2。

圖1 Western印跡檢測小鼠腎臟組織SGLT2表達

2.2依帕列凈可促進靶向SGLT2的miRNA表達增加 miR-370可靶向結合SGLT2基因的3′UTR區域，其序列為UUGGUCCAAGGUGGGGUCGUCCG-5′，共有8mer的配對序列。依帕列凈組腎臟中靶向SGLT2 mRNA的miR-370的表達量有明顯高于對照組(P<0.05)。見圖2、表1。

2.3依帕列凈可影響胰腺中糖尿病相關LncRNA的表達 與對照組比較，依帕列凈組Lnc-P12792、MALAT1的表達有下降，而KCNQOT1的表達量改變不明顯。依帕列凈組NF-κB(p65)較對照組顯著下降。見圖3、表1。

表1 兩組相關指標比較

表2 兩組不同時間體重及血糖比較

圖2 生物信息學預測靶向SGLT2的miRNA及靶向位點

圖3 Western檢測小鼠腎臟中LncRNA相關轉錄因子表達水平

3 討 論

T2DM及其心血管、腎臟并發癥的發生率呈上升趨勢。因此，除了生活方式的干預外，針對T2DM及其微血管和大血管并發癥的預防及治療，患者還需要使用不同種類的藥物。在抗糖尿病藥物中，二甲雙胍被認為是治療T2DM的初始藥物，但許多患者需要添加第二種藥物。SGLT2抑制劑的使用已被證實與許多T2DM患者的代謝和心血管益處相關，其處方率有望大幅增加。

依帕列凈是近年來應用于治療而型糖尿病的新型藥物，其對血糖及體重的控制有較明顯的作用。為了驗證抑制作用的可靠性，本研究結果顯示，依帕列凈有效抑制SGLT2的轉錄及蛋白水平，表明本研究給藥方法切實可行且與之前試驗研究一致〔10，11〕，對小鼠血糖含量檢測結果也顯示，給藥組小鼠的血糖含量降低到正常水平(100 mg/dl)。同時對小鼠體重監測結果顯示，依帕列凈可在降低血糖同時降低體重，這一結果與之前報道一致〔12〕。

隨后對依帕列凈抑制SGLT2表達的作用機制進行了研究。通過生物信息學軟件進行分析發現，只有miR-370靶向作用與SGLT2的mRNA，其特異性的結合于3′UTR區域，介導SGLT2 mRNA的降解抑制其表達。本研究結果提示依帕列凈作用機制之一可能通過促進miR-370的表達使得SGLT2的mRNA大量降解，從而抑制SGLT2蛋白的表達量。為了更進一步分析依帕列凈對糖尿病相關非編碼RNA的影響，本研究對給藥小鼠胰腺進行分離并提取了RNA及蛋白。Lnc-P12792、MALAT1兩種LncRNA的表達量有降低，而在之前的研究中發現在T2DM的胰島B細胞中這兩種LncRNA的表達量均有升高表達〔13，14〕。這一結果提示依帕列凈在抑制腎臟對血糖重吸收的同時也在分子水平上改善著胰島β細胞的功能。為了更進一步探究其調控的分子機制，本研究對腎臟組織蛋白樣品進行Western印跡檢測，實驗結果顯示其轉錄因子NF-κB(p65)的表達量有降低趨勢。該實驗結果證明，依帕列凈可能通過抑制轉錄因子NF-κB(p65)的表達從而降低Lnc-P12792、MALAT1兩種LncRNA的表達量。

綜上所述，依帕列凈抑制SGLT2的分子機制可能是通過促進miR-370的表達從而介導SGLT2 mRNA的降解并抑制其蛋白的表達，這一結果降低腎臟對血糖重吸收效率導致尿糖含量增加。同時依帕列凈在降低血糖的同時也通過調節LncRNA的表達改善著胰島細胞的功能，這一結果可能是長期正常血糖含量所引起的，同時也有可能是依帕列凈存在其他調節機制，這需要進一步實驗進行驗證。本研究為依帕列凈治療糖尿病的機制提供了新的依據與分析角度，也為評估其可能存在風險的分析提供新視野，即依帕列凈會引起轉錄因子及非編碼RNA的表達改變則會對機體造成其他影響。