酒曲中乳酸菌的篩選及其在板栗糯米飲料發酵中的應用

扈瑩紅，陳曉慧，常學東，王月穎，鄒 靜

（河北科技師范學院食品科技學院，河北秦皇島 066000）

板栗原產于我國，是我國食用最早的堅果之一。近年來，板栗的栽培面積和總產量迅速擴大，2018年我國板栗栽培面積已達34.1萬公頃，產量達196.5萬噸，與2008年相比收獲面積增長了31.15%，產量增長了35.52%[1]。板栗產業已經成為我國貧困山區的主要支柱產業，但是隨著板栗產量的逐年增加，板栗深加工能力弱、工業轉化率低等問題已成為制約板栗產業健康發展的瓶頸。因此急需開發附加值高、貨架期長、營養豐富、符合大眾健康要求的產品。

乳酸菌是一類可以利用碳水化合物產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱，具有突出的益生特性和發酵活性，廣泛應用于發酵食品的生產中[2]。研究表明，經過乳酸菌發酵而成的食品具有一定的益生功效，包括調節免疫系統[3]、降膽固醇含量[4]、調節腸道菌群、抑制腸道致病菌[5]、改善便秘[6]等，除此之外還具有抗衰老、抗氧化活性及降低腫瘤的風險[7?9]。隨著消費多樣化需求的日益增加，除了酸奶等傳統乳酸菌產品外，新興的乳酸菌發酵產品，如發酵的谷物、水果和蔬菜汁[10]等正逐漸被消費者接受。然而，現有乳酸菌存在非乳基質中生長繁殖狀態不佳及需要馴化的問題[11]，因此篩選適合植物基質發酵的乳酸菌是開發新型乳酸菌食品的關鍵問題之一。

米酒曲是以糧食、麩皮等為原料，通過自然網絡微生物或者人工接種而獲得的發酵劑，也是乳酸菌的主要供體。在釀造過程中，乳酸菌代謝產生的酸類、酯類物質可以影響酒的風味品質以及出酒率[12]。王丹丹等[13]對鳳窩酒曲中乳酸菌菌群進行鑒定，確定鳳窩酒曲中包含乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌（Weissella）兩個屬的乳酸菌。向凡舒等[14]從建始米酒曲中分離出10株乳酸菌，經鑒定4株為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、1株為乳酸片球菌（P.acidilactici）、2株為短乳桿菌（L.brevis）、3株為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。乳酸菌發酵過程中分泌的有機酸既能起到防腐作用，又可以改善原料的口感和風味[15]，從而提高產品的附加值，因此產酸能力是評價乳酸菌優良與否的指標之一[16?17]。耐受胃腸液是益生菌的重要特性之一[18]，因為人體胃腸的極端環境對乳酸菌的活性有很大影響，只有能夠耐受低pH、膽鹽和各種消化酶的菌株，才能在人體內存活，發揮其益生作用。

因此，本文以傳統米酒曲為乳酸菌供體，篩選出能夠在模擬胃腸環境中存活的、可以發酵植物基質的乳酸菌，并用篩選到的菌株為發酵菌株開發一款具有板栗風味的新型乳酸菌飲料，最后分析其品質及體外抗氧化能力，為板栗新型產品的開發提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安琪甜酒曲 安琪酵母股份有限公司；米曲樣品 來自四川內江、湖北秭歸縣、古塘客家三種自制米曲；燕龍板栗 河北遷安；糯米 吉林龍嘉米業有限公司；牛膽鹽、胃蛋白酶（3000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/g） 上海源葉生物科技有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基，純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鄰菲啰啉、硫酸亞鐵、30%過氧化氫 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；氫氧化鈉 分析純，天津歐博凱化工有限公司；MRS培養基 國藥集團化學試劑有限公司；MRSCaCO3培養基 在MRS培養基中補加1% CaCO3。

L530臺式低速離心機 湖南湘儀儀器設備有限公司；UV 2600A紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；SPX-250B-8生化培養箱 上海博迅實業有限公司；HOMOLAB均質機 意大利FBF公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌菌株的初步篩選 分別取三種酒曲各1 g于200 mL MRS液體培養基中，37 ℃富集培養，梯度稀釋后采用傾注法倒平板，放入37 ℃培養箱培養48 h。挑選溶鈣圈較大的菌落進行平板劃線純化，37 ℃培養48 h，反復多次純化，直至平板上菌落形態一致，然后進行革蘭氏染色、鏡檢，初步判定革蘭氏陽性菌為乳酸菌[19]。

將上述菌株接種到MRS培養基中，37 ℃培養24 h，得到種子液。將種子液以3%的接種量接入MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h后，取5 mL發酵液稀釋10倍后，滴加酚酞溶液，用0.1 mol/L標定后的氫氧化鈉溶液[20]滴定至粉紅色且30 s后不褪色，以未接種乳酸菌的培養基做空白對照，記錄消耗氫氧化鈉溶液體積，每株菌做3次檢測，結果取平均值[21]。其計算公式如下：

式中：X為樣品產酸量，g/L；V1為消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；V2為空白培養基消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；c為標定的氫氧化鈉溶液濃度，mol/L；V為發酵液體積，mL；N為稀釋倍數；0.09，乳酸的換算系數；1000，換算系數。

將產酸高的菌株純化后，置于20%的甘油中?80 ℃保藏。

1.2.2 乳酸菌菌株的復篩

1.2.2.1 耐酸能力分析 以2%（V/V）的接種量將篩選的乳酸菌分別接種于pH為3.0的MRS液體培養基中，37 ℃培養3 h，分別于0、3 h取樣，采用平板計數法計算活菌數[22?23]。乳酸菌的耐酸能力用公式（2）計算：

式中：N3為培養3 h的活菌數，CFU/mL；N0為0 h的活菌數，CFU/mL。

1.2.2.2 耐膽鹽能力分析 以2%（V/V）的接種量將篩選的乳酸菌分別接種于含0.3 g/100 mL牛膽鹽的MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，采用平板計數法計算0 h和24 h的活菌數[22?23]。乳酸菌的膽鹽耐受能力用公式（3）計算：

式中：N24為膽鹽處理24 h的活菌數，CFU/mL；N0為膽鹽處理0 h的活菌數，CFU/mL。

1.2.2.3 模擬胃腸液耐受性分析 模擬胃液：0.35 g胃蛋白酶溶于100 mL 0.2%的無菌生理鹽水，用鹽酸調節pH3.0過濾除菌；模擬腸液：胰蛋白酶0.1 g、膽鹽1.8 g溶于含有1.1 g NaHCO3、0.2 g NaCl的100 mL蒸餾水中，用NaOH調整pH8.0后過濾除菌[24]。

取10 mL種子液用無菌水離心洗滌3次后，用10 mL無菌水重懸，制成菌懸液。分別吸取1 mL待測菌株的菌懸液接入9 mL無菌人工模擬胃液中，共接2支，混勻，37 ℃培養3 h，其中，1支試管用于0 h和3 h的平板活菌計數，計算其耐受胃液能力。另1支試管模擬胃液處理3 h后在無菌條件下離心，并用無菌水離心洗滌2次后，用1 mL無菌水重懸，然后將其加入到9 mL無菌人工模擬腸液中，37 ℃處理8 h，每隔2 h取樣平板計數[24]。乳酸菌對人工模擬胃腸環境的耐受能力用公式（4）計算：

式中：N11為經過模擬胃、腸液處理11 h后的活菌數，CFU/mL；N0為未處理前的活菌數，CFU/mL。

1.2.2.4 乳酸菌耐受H2O2能力分析 將H2O2通過0.45 μm濾膜除菌后按比例加入至無菌的MRS液體培養基中，配制成含有0.4、0.7、1.0 mmol/L H2O2濃度的培養基，以2%（V/V）的接種量將乳酸菌菌懸液分別接種于含0.4、0.7、1.0 mmol/L H2O2的MRS液體培養基中，37 ℃培養16 h后，采用平板菌落計數法計算菌落數，以未加H2O2的培養基做對照試驗[25]。

1.2.3.1 完整細胞懸液和發酵上清液的制備 將菌株接入MRS液體培養基中，37 ℃培養12 h后，在5000 r/min條件下離心15 min，收集上清液即為菌株的發酵上清液。菌體用PBS緩沖溶液（pH7.4）離心洗滌三次后將菌體重懸于同體積的PBS緩沖溶液中得到完整細胞懸液。

1.2.3.2 清除DPPH自由基能力 取2 mL待測液（菌懸液或上清液），加入2 mL 0.01%的DPPH乙醇溶液，室溫下靜置30 min后在517 nm波長處測吸光度[26]。DPPH自由基清除率用公式（5）表示：

式中：A1為2 mL樣品+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A2為2 mL無水乙醇+2 mL樣品的吸光度；A0為2 mL蒸餾水+2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.2.3.3 清除羥自由基能力 取1 mL待測液（同1.2.3.2）于試管中，分別加入0.75 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液、2.5 mL磷酸緩沖溶液（pH7.4）、0.5 mL 0.1% H2O2、0.75 mL 7.5 mmol/L 鄰菲羅啉于37 ℃保溫1 h后在536 nm處測定吸光度[26]，羥自由基清除率用公式（6）表示：

式中：Ai為樣品組吸光度；A0為無樣品無H2O2組吸光度；A為無樣品組吸光度。

1.2.3.4 SOD酶活力測定實驗 參照國標GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》中鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活力[27]。

平常日子，腦子轉的速度不必那樣快，步子的頻率不必那樣高，聲音的分貝不必那樣強，睡眠的時間也不必那樣晚……

1.2.4 菌株的分子生物學鑒定 將篩選得到的菌株送往華大基因進行菌株的16S rDNA序列測序。然后登陸GenBank中的BLAST程序比對測序菌株，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，利用MEGA5軟件中的鄰接算法構建系統發育樹。

1.2.5 板栗糯米乳酸菌發酵飲料的制備及指標測定

1.2.5.1 工藝流程

1.2.5.2 操作要點 a.乳酸菌發酵劑的制備：將菌株接入MRS液體培養基中，37 ℃培養12 h后，在5000 r/min條件下離心15 min棄上清液，菌體用無菌水同等條件下離心洗滌兩次后，用無菌水調節菌落數至約108CFU/mL。

b.板栗發酵：板栗去殼后洗凈、破碎成塊，蒸30 min冷卻后按0.4%（質量比）添加安琪甜酒曲，按0.3%（質量比）的添加量添加乳酸菌，30 ℃發酵24 h后，按料液比1:4（g/mL）加水破壁機打漿1 min。

c.糯米發酵：取糯米50 g，淘洗3次后，加200 mL水浸泡12 h，瀝干水分后蒸30 min，冷卻，按0.4%（質量比）添加安琪甜酒曲，按0.3%（質量比）添加乳酸菌，30 ℃發酵48 h后，按料液比1:4加水攪拌均勻后紗布過濾得發酵糯米汁。

d.混合：將板栗汁與糯米汁按體積比為1:4混合。

e.均質：紗布過濾除去大顆粒后，添加0.1%黃原膠，使用均質機在60 ℃、35 MPa條件下均質兩次。

f.滅菌：罐裝后放入85 ℃水浴鍋中15 min。

1.2.5.3 感官評價 邀請10位有感官評價經驗的專業人員（男:女=1:1），根據表1對板栗糯米飲料的顏色、組織狀態、口感、風味四個指標進行評分，記錄數據取平均值。

表1 板栗糯米乳酸飲料感官評分標準Table 1 Sensory rating of chestnut glutinous rice lactic acid beverage

1.2.5.4 酸度測定 參照國標GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》滴定酸度[28]。

1.2.5.5 抗氧化能力測定 板栗糯米飲料離心后取上清液，參照1.2.3.3中方法測定羥基自由基清除率，參照1.2.3.4中方法測定SOD酶活力；將上清液稀釋10倍，參照1.2.3.2中方法測定DPPH自由基清除率。

1.3 數據處理

采用Excel 2016和SPSS 23.0軟件進行統計學分析，數據間的分析采用單因素方差分析和Duncan多重比較法，顯著性水平設定為0.05；繪圖采用Origin 2018。

2 結果與分析

2.1 酒曲中高產酸乳酸菌的初篩

產酸能力是乳酸菌的重要益生特性，乳酸可以降低pH、抑制或殺死病原菌、提高胃腸道消化酶活性[29]。從四川內江甜酒曲、湖北秭歸縣黃酒曲、古塘客家甜酒餅中共分離出84株具有溶鈣圈、革蘭氏染色呈陽性的菌株，初步判定為乳酸菌。以在MRS-CaCO3固體培養基上形成的透明溶鈣圈的大小來初步判定其產酸能力，測定了其中38株溶鈣圈大的菌株產酸能力，具體產酸量見表2，這38株菌的產酸量均大于10 g/L，最大值為18.14 g/L，最小值為10.07 g/L。

表2 38株乳酸菌的產酸能力Table 2 Acid production capacity of 38 lactic acid bacteria

2.2 具有較強耐受能力乳酸菌的篩選

2.2.1 耐酸乳酸菌的篩選 乳酸菌經由胃后進入小腸，而胃液pH通常在3.0左右，因此乳酸菌在低pH下的存活能力即耐酸能力是評價其益生性的重要指標之一[30]。根據食物在胃部的停留時間，本文將初篩的38株乳酸菌在pH3.0的液體MRS培養基中培養3 h，篩選耐酸能力強的乳酸菌進行后續實驗。王帥等[31]的研究表明菌株耐受能力超過60%時，具有較好的耐受胃腸環境能力，因此本文以耐受能力60%為指標，篩選出25株菌的耐酸能力≥60%，進行下一步實驗，其中，耐酸能力達到90%以上的共有6株（詳見表3）。

表3 38株乳酸菌的耐酸能力Table 3 Acid tolerance of 38 strains of lactic acid bacteria

2.2.2 耐膽鹽菌株的篩選 小腸是乳酸菌發揮益生作用的重要部位，正常人體小腸中膽汁鹽含量在0.03%~0.3%范圍內波動，膽鹽可以改變菌體外膜的通透性并對菌體的脫氧核糖核酸產生傷害，進而影響乳酸菌在人體腸道的定植[30]，因此，耐膽鹽能力是評價乳酸菌能否在人體胃腸道發揮益生作用的重要指標。以25株耐酸能力強的乳酸菌為出發菌株，按照方法1.2.2.2測定其耐膽鹽能力，結果見圖1。結果顯示，共有10株乳酸菌對0.3%濃度的膽鹽耐受能力≥60%，其中最高的是菌株DH24，其耐受能力為（96.48%±0.46%），因此，以這10株乳酸菌進行后續的篩選。

圖1 25株乳酸菌耐膽鹽能力分析Fig.1 Ability of tolerance bile salt of 25 strains lactic acid bacteria

2.2.3 耐模擬胃腸道環境菌株的篩選 盡管前面已經通過酸度以及膽鹽含量來模擬了人體的胃腸環境，但真正的人體胃腸中還含有胃蛋白酶和胰蛋白酶，這些酶可以水解微生物的菌體蛋白質，抑制甚至殺死微生物[32]，因此，對耐酸耐膽鹽的10株乳酸菌的耐模擬胃腸環境能力進行了分析，結果如圖2所示。經過3 h的模擬胃液處理，10株乳酸菌的活菌數均明顯降低，這說明胃液環境對微生物有明顯的抑制甚至殺滅作用。經模擬胃液消化后DH16和DH24活菌數下降了1~2 lg CFU/mL，菌株DH20和DH35活菌數下降了2~3 lg CFU/mL，其余乳酸菌活菌數減少量超過3 lg CFU/mL。經模擬腸液消化后，乳酸菌的活菌數持續減少，其中，在模擬腸道環境中存活能力最好的是菌株DG39，活菌數僅減少了0.32 lg CFU/mL。經處理11 h后的結果表明菌株DH24的活菌數最高為6.02 lg CFU/mL，DH16和DH20的活菌數略低于菌株DH24，分別為5.98、5.54 lg CFU/mL，其余菌株活菌數均小于5 lg CFU/mL。菌株DH16、DH20和DH24三株乳酸菌對模擬胃腸環境有較好的耐受性，耐受能力≥60%，進入下一步實驗。

圖2 10株乳酸菌耐受人工模擬胃腸液能力分析Fig.2 Tolerance ability of 10 strains lactic acid bacteria in artificial simulated gastric and intestinal fluid

2.2.4 菌株耐受H2O2能力 氧化劑可以激發機體氧化防御系統產生各種酶，當微生物受到低濃度H2O2處理時，細胞會產生適應能力，來保護自身免受更高濃度氧化劑的危害，因此 H2O2耐受力可作為衡量菌體抗氧化活性的一個指標[33]。本研究將三株乳酸菌接種于含有不同濃度H2O2的MRS培養基中，37 ℃培養16 h后的活菌數見表4。由表4可知三株菌在含有0.4、0.7、1.0 mmol/L濃度的H2O2培養基中的活菌數與空白對照組無顯著差異（P>0.05），這表明這三株乳酸菌均具有氧化防御系統，對H2O2有一定的耐受力。

表4 乳酸菌對過氧化氫的耐受能力Table 4 Resistance of lactic acid bacteria to hydrogen peroxide

2.3 菌株體外抗氧化能力分析

當機體代謝過程中產生的自由基含量過高時，生物大分子與其結合會造成機體損傷，引發多種疾病[34]。因此探究了這三株乳酸菌的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力以及SOD酶活力。由表5可知，同一株乳酸菌的上清液和細胞懸液對DPPH自由基的清除能力不同，發酵上清液要優于完整細胞懸液，三株乳酸菌的發酵上清液均表現出較強的DPPH自由基清除能力，發酵上清液中以菌株DH16的清除率最高為（98.56%±0.74%），完整細胞懸液中以菌株DH20對DPPH自由基的清除能力最高為（22.49%±0.71%）。林祥娜等[33]研究的8株乳酸菌發酵上清液和完整細胞懸液的DPPH自由基清除能力也發現上清液的DPPH自由基清除力要高于細胞懸液。菌株DH16發酵上清液和完整細胞懸液對羥自由基的清除能力均高于另外兩株，且菌株DH24和DH20發酵上清液、菌體的羥自由基清除能力差異不顯著（P>0.05）。同樣可以發現發酵上清液的羥自由基清除能力高于完整細胞懸液，這可能是因為菌株發酵上清液的SOD酶活力高于完整細胞懸液[35]，也可能因為乳酸菌代謝產物中存在更多的清除自由基活性物質，比如硫氧還蛋白、谷胱甘肽等還原性物質[36]。此外，這3株乳酸菌發酵上清液的SOD酶活力差異顯著，菌株DH16的發酵上清液SOD酶活力高于另外兩株（P<0.05）。

表5 3株乳酸菌的抗氧化能力Table 5 Antioxidant capacity of three strains lactic acid bacteria

2.4 菌株鑒定

對這3株乳酸菌的16S rDNA基因序列進行分析、比對，利用MEGA5軟件構建系統發育樹如圖3所示。由圖3可知菌株DH16、DH20、DH24與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）聚于一支，親緣關系最近，因此將這三株菌鑒定為戊糖片球菌（P.pentosaceus）。有研究表明戊糖片球菌（P.pentosaceus）可抑制食源性致病菌、調節腸道免疫功能、降低膽固醇、抗氧化、抗腫瘤等，用于發酵食品工業化生產中，可以提高產品的品質、安全性及生產效率[2, 37]。

圖3 基于16S rDNA基因序列的片球菌屬系統進化樹Fig.3 Evolutionary tree of Pediococcus based on 16S rDNA gene sequence

2.5 板栗糯米乳酸菌飲料的品質評價

2.5.1 感官評分 感官評分是食品品質測評的重要方法，綜合四項指標得分發現3株乳酸菌發酵的板栗糯米乳酸飲料酸甜可口、組織狀態均勻一致，板栗風味濃郁，感官評分較高，其中以DH20菌株發酵的飲料評分最高。

表6 不同乳酸菌發酵飲料的感官得分Table 6 Sensory scores of beverages fermented by different lactic acid bacteria

2.5.2 酸度 乳酸菌發酵過程中產生的酸可以起到改善產品風味口感的作用，因此產品的酸度是評判產品品質的重要指標，也可作為評判菌株發酵能力的指標之一，由圖4可知，不同乳酸菌發酵得到的板栗糯米飲料酸度有所差異，酸度由高到低分別是菌株DH20>DH24>DH16，說明菌株DH20在板栗糯米飲料中發酵能力最強。

圖4 不同乳酸菌發酵飲料的酸度Fig.4 Acidity of fermented beverages by different lactic acid bacteria

2.5.3 體外抗氧化活性 對三株乳酸菌發酵的板栗糯米飲料的羥自由基、DPPH自由基清除率、SOD酶活力進行測定，結果見圖5。由圖5可以看出乳酸菌發酵的板栗糯米飲料有一定的抗氧化能力，DH16發酵飲料的DPPH自由基、羥自由基清除率顯著高于另外兩株（P<0.05）。3株乳酸菌發酵的板栗糯米飲料的SOD酶活力大小依次為菌株DH16>DH20>DH24，其中，DH16和DH20發酵飲料的SOD酶活力差異不顯著（P>0.05）。本研究中乳酸菌發酵的板栗糯米飲料，口感協調，感官良好且具有一定的抗氧化能力，因此，本實驗篩選的乳酸菌適宜生產板栗糯米發酵飲料，可為其他植物基發酵飲料的研發提供參考依據。

圖5 不同乳酸菌發酵飲料的抗氧化活性分析Fig.5 Antioxidant activity of fermented beverages by different lactic acid bacteria

3 結論

本研究從三種米酒曲樣品中分離出了84株乳酸菌，經篩選后得到3株戊糖片球菌（P. pentosaceus），產酸量大于10 g/L、模擬胃腸環境試驗后活菌數大于5.5 lg CFU/mL，同時具備一定的自由基清除能力和SOD酶活性。用其發酵得到的板栗糯米乳酸菌飲料，酸甜適中、口感協調、抗氧化能力較好，具有一定的應用前景。其中，以菌株DH20發酵的飲料感官評分值最高，達到82.2分，酸度為1.76 g/L，DH16發酵的飲料抗氧化活性最強，DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、SOD酶活力分別為28.8%、36.47%、14 U/mL，在實際應用中可根據實際需求選擇合適的菌株，或將3株乳酸菌按一定比例復配應用到生產中，以發揮出每個菌株各自的優勢。因此本實驗中的3株乳酸菌可作為植物發酵的潛在益生菌，改善當前適用于植物基發酵乳酸菌較少的現狀，促進非乳制品乳酸菌發酵行業的發展，對提高乳酸菌類生物制品的市場競爭力有重要意義。