植物乳桿菌HCS03-001安全性評價及其益生特性分析

矯艷平，余 萍，趙 迪，張春宇，宋 佳，湯 純，曹 藍

（江西仁仁健康產業有限公司，江西樟樹 331200）

近年來，人們越來越意識到腸道微生態對人體健康的重要性，益生菌作為定植于腸道內并對人體健康有益的活性微生物，被廣泛應用于各種發酵食品、功能性食品、藥品及膳食補充劑等。益生乳酸菌即發酵糖類產生乳酸的益生菌，在食品應用中未發現過嚴重的不良反應，普遍認為乳酸菌的應用是安全的[1]。然而，陸續有研究表示從敗血癥、心內膜炎、急性胰腺炎和尿路感染患者體內分離出了乳酸菌，還有關于攝入乳酸菌引起局部或全身感染的報道，使乳酸菌的安全性進入人們關注的視野，并將其作為乳酸菌應用的前提條件[2?3]。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是一類存在于人體腸道內并發揮益生作用的革蘭氏陽性益生菌群[4]。大量研究表明，植物乳桿菌具有調節免疫功能[5?6]、調節血糖、血脂和血壓平衡[7?11]、抑制胃腸道致病菌感染[12?15]、調節腸道功能[16?18]、調節神經功能[19?20]等作用，其作為乳酸菌的一種，其安全性被高度認可，并應用于多種食品、飼料、醫療保健等領域[21]。植物乳桿菌發揮益生作用的基礎是其能夠耐受胃酸環境和十二指腸的高膽鹽環境，攝入后能夠以活菌狀態到達小腸和大腸，繼而發揮益生功能[22]。

分離自哺乳嬰兒腸道及母乳中的人源性益生菌株更能夠在人體腸道內存活[23]。本研究對從嬰兒糞便樣品中篩選出的植物乳桿菌HCS03-001的安全性進行了評價，并測定其對酸和膽鹽的耐受能力，為其進一步應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌HCS03-001 分離自順產健康8月齡女嬰糞便樣品，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.16258；清潔級昆明種（KM）小鼠（18~22 g） 沈陽艾克賽斯生物科技有限公司（許可證號：NO.SCXK（遼）2020—0001）；塊狀鼠料 遼寧長生生物技術有限公司；哥倫比亞血瓊脂平板 無錫賽維商務有限公司；鹽酸洛哌丁胺 西安楊森制藥有限公司；肺炎鏈球菌ATCC49619 上海復祥生物科技有限公司；英諾克李斯特氏菌CICC 10417、金黃色葡萄球菌CICC 10473 中國工業微生物菌種保藏管理中心；梅里埃E-Test藥敏試條 北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司；膽鹽（HPLC級SIGMA） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、福氏志賀氏菌CMCC（B）51572、單增李斯特菌ATCC19115

上海魯微科技有限公司；牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277 中國普通微生物菌種保藏管理中心；白色念珠菌ATCC10231 青島高科技工業園海博生物技術有限公司；大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC12598、變異鏈球菌GIM1.530 廣東省微生物菌種保藏中心；鹽酸洛哌丁胺膠囊（含鹽酸洛哌丁胺2 mg/粒） 西安楊森制藥有限公司；植物乳桿菌HCS03-001培養基：酵母蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L，葡萄糖20 g/L，檸檬酸5 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.08 g/L，吐溫80 0.6 g/L，余量為純化水，pH6.60，115 ℃滅菌30 min。

SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DHP-500BS電熱恒溫培養箱 北京市永光明醫療儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；XSP-10CA生物顯微鏡

上海佑科儀器儀表有限公司；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司；TGL-16M低溫高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；FiveEasy Plus型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MHY-28473麥氏濁度計 北京美華科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將植物乳桿菌HCS03-001菌種凍存管置37 ℃水浴鍋中使其迅速溶化，取100 μL菌液加入10 mL植物乳桿菌HCS03-001液體培養基中，37 ℃培養16 h后擴大培養至100 mL，放4 ℃備用。

1.2.2 溶血試驗 將已活化好的HCS03-001菌株菌懸液接種點樣于哥倫比亞血瓊脂平皿中，在同一平皿中接種點樣陰性對照菌英諾克李斯特氏菌CICC 10417和陽性對照菌金黃色葡萄球菌CICC 10473，37 ℃培養48 h，觀察平皿中菌落周圍有無溶血圈出現并拍照記錄。

1.2.3 耐藥性試驗 采用E試驗法對植物乳桿菌HCS03-001進行耐藥性評價。挑取純化后的植物乳桿菌HCS03-001菌落接種至MRS培養基，并于35 ℃培養至濁度達到0.5麥氏單位以上，用生理鹽水調節菌液濃度至0.5麥氏單位。用無菌棉沾取菌懸液涂布于90 mm的MRS瓊脂平板表面，反復涂布3次，每次旋轉平板60°，室溫下靜置5 min，用無菌鑷子夾取E-test試條緊貼于MRS瓊脂培養基表面，15 min后將平板置5%二氧化碳環境孵育24~48 h后讀取抑菌圈邊緣與E-test藥敏條相交處的MIC值。以肺炎鏈球菌ATCC49619為質控菌株，藥物敏感性結果依據CLSI M45-A3（2015）標準執行，判定標準見表1。

表1 乳桿菌屬藥敏試驗判定標準（μg/mL）Table 1 Criteria for antimicrobial susceptibility test of Lactobacillus (μg/mL)

1.2.4 急性經口毒性試驗 按照GB15193.3-2014限量法評價植物乳桿菌HCS03-001對小鼠的經口急性毒性。將20只實驗小鼠分為雌性組和雄性組。實驗環境設置為溫度22±1.5 ℃，濕度50%±10%，工作照度160~280 Lux，噪音<60 dB，給予鼠糧和純凈水，適應環境3 d后進行實驗。實驗前小鼠禁食不禁水6 h。將植物乳桿菌HCS03-001菌粉（1×1011CFU/g，菌粉基質為麥芽糊精）按照15 g/kg的劑量，20 mL/kg的灌胃體積，灌胃小鼠一次，灌胃后觀察14 d，記錄中毒癥狀及死亡情況。

1.2.5 耐酸性試驗 用1 mol/L鹽酸將MRS培養基pH調成2.0和3.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻備用。將活化后的植物乳桿菌HCS03-001菌液以10%（V/V）的接種量分別接種于pH3.0、pH2.0的MRS培養基中。37 ℃恒溫靜置培養，于0、1、2、3 h用滅菌的生理鹽水進行10倍系列稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1000 μL移入無菌空平皿中，將冷卻至48 ℃的MRS瓊脂培養基傾注入平皿約15 mL，轉動平皿使其混合均勻。每個稀釋度3次重復，37 ℃靜置培養48 h后計數。耐酸試驗存活率計算公式（1）如下：

式中：Nt為1、2、3 h測得的活菌數，lg CFU/mL；N0為0 h測得的活菌數，lg CFU/mL。

1.2.6 耐膽鹽試驗 在MRS培養基中加入牛膽鹽，配制膽鹽質量濃度分別為0.3、0.5、1.0、1.5 g/L的MRS培養基，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻備用。將活化后的植物乳桿菌HCS03-001菌液按照10%（V/V）的接種量分別接種于上述培養基中，37 ℃恒溫靜置培養，于0、1、2、3 h用滅菌的生理鹽水進行系列10倍稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1000 μL移入無菌空平皿中，將冷卻至48 ℃的MRS瓊脂培養基傾注入平皿約15 mL，轉動平皿使其混合均勻。每個稀釋度3次重復，37 ℃靜置培養48 h后計數。耐膽鹽試驗菌株存活率計算方法見公式（2）。

式中：N1為1、2、3 h測得的活菌數，lg CFU/mL；N0為0 h測得的活菌數，lg CFU/mL。

1.2.7 抑菌功能特性試驗 試驗以大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC12598、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、志賀氏菌CMCC（B）51572、單增李斯特菌ATCC19115、白色念珠菌ATCC10231、牙齦卟啉單胞菌ATCC33277、變異鏈球菌GIM 1.530為指示菌，采用牛津杯法[24]測定HCS03-001代謝產物的抑菌性。

1.2.7.1 植物乳桿菌HCS03-001發酵液濃縮 取一菌株凍存管在37 ℃水浴鍋中使其迅速溶化，用微量移液器取10 μL菌液加入4.5 mL生理鹽水中，逐級稀釋至10-6，取稀釋液50 μL涂布平板，37 ℃培養24~48 h，挑取單菌落于5 mL培養基中37 ℃培養20 h，5%接種量擴大培養至100 mL培養基中，37 ℃培養17 h后，10000 r/min離心10 min，取上清，加熱100 ℃濃縮至5倍，放4 ℃備用。

1.2.7.2 抑菌圈直徑測量 分別將指示菌加入到對應的液體培養基中進行活化并稀釋菌液濃度為105CFU/mL，取菌懸液100 μL均勻涂布于培養基上。用鑷子將無菌牛津杯豎于涂布有致病菌液的平皿中，牛津杯中加入200 μL活化后的植物乳桿菌HCS03-001濃縮上清液。將平皿置于37 ℃的恒溫培養箱中，24 h后觀察拍照，并用游標卡尺計量抑菌圈直徑。

對應培養基：大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC12598：LB培養基；鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、志賀氏菌CMCC（B）51572：營養瓊脂培養基；單增李斯特菌ATCC19115：TSA-YE培養基；白色念珠菌ATCC10231：SB培養基；牙齦卟啉單胞菌ATCC33277：TSA+5%脫纖維羊血；變異鏈球菌GIM1.530：BHI培養基。

1.2.8 小鼠通便功效試驗

1.2.8.1 試劑和動物準備 試驗選用清潔級昆明種（KM）小鼠40只，18~22 g，雄性。試驗環境為清潔級動物實驗室，溫度22±1.5 ℃，濕度50%±10%，工作照度160~280 lx，噪音<60 dB。

鹽酸洛哌丁胺混懸液的配制：取鹽酸洛哌丁胺膠囊10粒或20粒，去除囊殼，將藥粉加蒸餾水定容至100 mL配制成0.02%或0.04%的濃度。

墨汁配制方法：將阿拉伯膠5 g與40 mL蒸餾水混合煮沸至澄清透明，再與2.50 g活性炭粉混合均勻煮沸3 次，冷卻，蒸餾水定容至50 mL，置于4℃冰箱保存備用。

1.2.8.2 小腸運動試驗 經口灌胃給予造模藥物鹽酸洛哌丁胺，建立小鼠小腸便秘模型，計算一定時間內小腸的墨汁推進率，來判斷小腸蠕動功能。以植物乳桿菌HCS03-001菌粉（1×1011CFU/g）為受試物，根據人體推薦量的10倍量將試驗設置2個劑量組（受試物1.5 g/kg及3.0 g/kg）、一個空白對照組和一個模型對照組。將植物乳桿菌HCS03-001菌粉溶于蒸餾水中，每天灌胃一次，灌胃體積為10 mL/kg，模型對照組和空白對照組灌胃同體積蒸餾水，共給予21天后，劑量組和模型對照組給予0.02%的鹽酸洛哌丁胺混懸液（鹽酸洛哌丁胺5 mg/kg BW）造便秘模型，造模0.5 h后，各組小鼠均灌胃10 mL/kg墨汁，計時20 min后處死小鼠，解剖，測量小腸全長及自胃部下端幽門處到墨水運動前沿的距離，小腸推進率按公式（3）計算。

1.2.8.3 排便粒數、排便時間試驗 經口灌胃給予造模藥物鹽酸洛哌丁胺，建立小鼠便秘模型，考察實驗動物6 h內排黑便粒數與首次排黑便時間，來反映模型排便情況。以植物乳桿菌HCS03-001菌粉（1×1011CFU/g）為受試物，試驗設置2個劑量組（受試物1.5 g/kg及3.0 g/kg）、一個模型對照組和一個空白對照組，將植物乳桿菌HCS03-001菌粉溶于蒸餾水中，每天灌胃一次，灌胃體積為10 mL/kg，模型對照組和空白對照組灌胃同體積蒸餾水，共給予8 d后，劑量組和模型對照組給予0.04%的鹽酸洛哌丁胺混懸液（鹽酸洛哌丁胺10 mg/kg BW）造便秘模型，造模0.5 h后，各組小鼠均灌胃10 mL/kg墨汁，開始記錄首粒排黑便時間和6 h內排黑便粒數。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次平行測定，數據采用SPSS 19.0軟件和Excel軟件進行數據分析，當P<0.05時，差異被認為是有意義的，結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 溶血性評價結果

測定乳酸菌溶血現象是評價乳酸菌安全性的一項重要指標。溶血試驗結果如圖1所示，將已活化好的HCS03-001菌株菌懸液、陰性對照菌英諾克李斯特氏菌CICC 10417和陽性對照菌金黃色葡萄球菌CICC 10473接種點樣于哥倫比亞血瓊脂平皿中，37 ℃培養48 h后，陽性對照菌金黃色葡萄球菌CICC 10473出現明顯的透明圈，表現為溶血。植物乳桿菌HCS03-001與陰性對照菌英諾克李斯特氏菌CICC 10417結果一致，均無透明圈，即不溶血。說明植物乳桿菌HCS03-001在溶血性方面是安全的。

2.2 耐藥性評價試驗結果

益生菌中是否含有抗生素抗性基因，抗性基因是否會在腸道正常菌群與致病菌之間發生轉移，已成為評價菌株安全性的一個重要方面[25]。植物乳桿菌HCS03-001耐藥性實驗結果見表2所示。植物乳桿菌HCS03-001對青霉素（PEN）、氨芐西林（AM）、亞胺培南（IP）、美羅培南（MP）、利奈唑胺（LZ）、達托霉素（DPC）敏感，對紅霉素（EM）中敏，對萬古霉素（VA）耐藥。目前針對益生菌的耐藥性質有認為其攜帶耐藥基因并可能轉移至宿主體內，還有觀點認為這種耐受通常是自身內在染色體編碼的，不具轉移性[26]。眾多關于乳酸菌研究均對一種或多種抗生素有耐受現象，其耐受原因及是否能夠轉移有待進一步研究。

2.3 急性經口毒性試驗結果

植物乳桿菌HCS03-001急性經口毒性試驗結果如表3所示。雌雄小鼠精神狀況良好，觀察期內體重保持增長，無中毒或死亡情況發生；解剖后未見心肝脾肺腎等內臟器官異常。根據《食品安全國家標準急性經口毒性試驗》 GB15193.3-2014，植物乳桿菌HCS03-001的經口急性毒性耐受劑量大于15 g/kg，其LD50>15 g/kg。

表3 植物乳桿菌HCS03-001小鼠急性經口毒性試驗結果Table 3 Acute oral toxicity test of Lactobacillus plantarum HCS03-001

2.4 菌株HCS03-001的耐酸試驗結果

益生菌進入人體后主要在腸道內發揮有益作用，因此必須具有較強的耐受胃酸能力，才能以較高的存活性通過胃環境。人體在空腹時胃液pH為2.0以下，進食后pH能達到3.0左右[27]。因此試驗選定pH3.0和pH2.0進行檢驗菌株HCS03-001的耐酸性能力，試驗結果見表4。由表4可知，菌株HCS03-001在pH2.0和pH3.0、37 ℃條件下培養3 h，雖活菌數對數值較0 h時顯著下降（P<0.05），但存活率存活率仍達92.33%和94.29%。說明該菌株對酸環境具有一定的耐受能力，其耐酸能力可能與菌株的雙組分信號調節及酸環境下細胞膜組成變化、蛋白質和DNA的損傷修復等耐酸機制有關[28]。

表4 菌株HCS03-001的耐酸試驗結果（n=3）Table 4 Result of acid resistance tests of strain HCS03-001(n=3)

2.5 菌株HCS03-001的耐膽鹽試驗結果

益生菌能夠在腸道內保持存活性，較強的膽汁的耐受能力是先決條件。菌株HCS03-001經0.3、0.5、1.0、1.5 g/L牛膽鹽處理后的存活率見表5。隨著牛膽鹽含量的增加和處理時間的延長，菌株HCS03-001的存活率呈下降趨勢，當牛膽鹽含量達到1.5 g/L時，處理3 h后活菌數對數值較0 h雖顯著下降(P<0.05)，但存活率仍能達到88.82%，說明該菌株耐膽鹽能力較強，有利于其在宿主腸道中的定植，其對膽鹽的耐受能力可能是由于該菌株在生長繁殖過程中產生膽鹽水解酶來降低膽鹽對自身細胞的危害或其表層蛋白對細胞的保護作用等[29]。

表5 菌株HCS03-001的耐膽鹽試驗結果（n=3）Table 5 Results of bile salt tolerance tests of strain HCS03-001(n=3)

2.6 抑菌功能性試驗結果

乳酸菌能夠產生有機酸、過氧化氫等代謝產物、分泌細菌素，具有抑制致病菌生長及減少腐敗菌毒素產生的作用，因此抑菌功能是乳酸菌重要的益生特性[30]。試驗選取大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、單增李斯特菌、牙齦卟啉單胞菌、變異鏈球菌為指示菌，結果見表6所示。植物乳桿菌HCS03-001發酵上清液對腸道致病菌及口腔致病菌（牙齦卟啉單胞菌和變異鏈球菌）均有一定程度的抑制作用，其中對變異鏈球菌的抑菌圈直徑最大，顯著高于其他菌株（P<0.05）；對大腸埃希氏菌ATCC25922與金黃色葡萄球菌ATCC12598的抑菌圈直徑與周欽育等[31]所測LGG抑菌圈直徑接近。

表6 植物乳桿菌HCS03-001抑菌特性試驗結果Table 6 Experimental results of antimicrobial properties of Lactobacillus plantarum HCS03-001

2.7 通便功效試驗結果

2.7.1 小腸運動試驗 經口灌胃給予造模藥物鹽酸洛哌丁胺，建立小鼠小腸便秘模型，給予植物乳桿菌HCS03-001灌胃21 d，試驗結果見表7，與空白對照組（75.59%）相比，模型對照組小鼠的小腸墨汁推進率（32.38%）顯著降低（P<0.05），說明小鼠便秘模型構建成功。與模型對照組相比，受試物在1.5和3.0 g/kg的劑量下，小鼠的小腸墨汁推進率均顯著提高（P<0.05），分別為49.08%、52.05%，說明植物乳桿菌HCS03-001對鹽酸洛哌丁胺造模的小鼠便秘模型有一定的通便效果。

表7 小腸運動試驗結果Table 7 Results of intestinal motility test

2.7.2 排便粒數、排便時間試驗 經口灌胃給予造模藥物鹽酸洛哌丁胺，建立小鼠便秘模型，以植物乳桿菌HCS03-001為受試物，考察實驗動物6 h內排黑便粒數與首次排黑便時間。試驗結果見表8，與空白對照組相比，模型對照組的6 h內排黑便粒數顯著降低（P<0.05），首次排黑便時間顯著增加（P<0.05），說明小鼠便秘模型構建成功。經過服用受試物后，1.5和3.0 g/kg劑量組的6 h排黑便粒數顯著高于模型對照組（P<0.05），首次排黑便時間顯著短于模型對照組（P<0.05），說明植物乳桿菌HCS03-001對鹽酸洛哌丁胺的便秘模型有較好的排便效果。

表8 排便粒數、排便時間試驗結果Table 8 Defecation particle number and defecation time

3 結論

通過對植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）HCS03-001的安全性評價，該菌株在溶血性實驗中表現為不溶血，無致病性；耐藥實驗中，對青霉素（PEN）、氨芐西林（AM）、亞胺培南（IP）、美羅培南（MP）、利奈唑胺（LZ）、達托霉素（DPC）敏感，對紅霉素（EM）中敏，對萬古霉素（VA）耐藥；在急性經口毒性實驗中，小鼠精神狀況較好，進食穩定，各內臟器官無異常，無中毒情況發生。在益生特性評價試驗中，該菌株對酸及膽鹽環境的耐受性良好，對腸道主要革蘭氏陽性與革蘭氏陰性致病菌及口腔致病菌（牙齦卟啉單胞菌和變異鏈球菌）均有抑制作用，對小鼠的鹽酸洛哌丁胺的便秘模型有較好的促排便效果。綜上，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）HCS03-001具有良好的安全性及益生特性，為進一步生產應用提供了理論基礎。