免疫富集聯合MALDI-TOF MS檢測奶粉中阪崎克羅諾桿菌的方法建立

趙 宏，楊 柳 ，趙良娟，龐 璐，張俊哲，朱韶英，趙玉玲，譚有蘭，趙化冰，劉 培，劉國紅，吳 嵐，董志珍,4,

（1.天津海關動植物與食品檢測中心，天津 300461；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；3.中華人民共和國呼和浩特海關，內蒙古呼和浩特 010090；4.天津市口岸非傳統安全風險防控科學與技術重點實驗室，天津 300461）

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii，CS）是一種可寄生于人和動物腸道內的食源性條件致病菌[1?2]，具有易存活、耐高溫（54~62 ℃）、耐酸（pH<3.9）、耐干燥及繁殖能力強等特點，在低溫、干燥等惡劣環境中極微量的污染就可能進行大量繁殖，是引起新生兒食源性疾病的致病菌之一[1?4]。研究發現，嬰幼兒配方乳粉是新生兒感染阪崎克羅諾桿菌的主要途徑，據研究報道顯示，食用被阪崎克羅諾桿菌污染的奶粉會導致新生兒腦膜炎、小腸結腸炎、敗血癥等疾病，治愈后仍可能引起神經系統后遺癥，流行病學研究顯示，其病死率約為50%~80%[2,5?7]。

1961年英國首次報道出現由阪崎克羅諾桿菌污染引起的新生兒腦膜炎病例[8]，隨后越來越多的病例被報道。2002年，阪崎克羅諾桿菌被國際食品微生物標準委員會列為“嚴重危害特定人群生命，引起長期慢性實質性后遺癥”的一種致病菌[9]。2005年我國國家質檢總局頒布了奶粉中檢測阪崎克羅諾桿菌的行業標準SN/T1632.1，隨后又頒布了嬰幼兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌每批必檢的市場準入要求[9?10]。

盡管目前已建立了多種準確靈敏、特異性好的阪崎克羅諾桿菌檢測方法，但這些方法仍然存在不足，傳統的國家標準檢測方法[11]檢測周期長，至少需要6 d才能鑒定出結果；分子生物學檢測方法[3,12]易受試劑及環境污染，存在漏檢及假陽性問題；單一免疫學檢測方法因檢出限較高而受限制[13]；全基因組測序方法[14]樣品前處理要求高且復雜，結果分析對于檢測人員的相關背景要求較高，因此，本研究將具有較好的特異性、準確性及靈敏性的免疫（immunomagnetic beads, IMB）富集技術[15?16]與靈敏度高、分析速度快、樣品制備簡單的新型軟電離質譜技術-基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）[17?18]相結合用于檢測嬰幼兒配方乳粉中的阪崎克羅諾桿菌，以克服以上檢測技術存在的檢測周期長、特異性不高等問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阪崎克羅諾桿菌標準菌株（Cronobacter sakazakiiATCC 12868、ATCC 29004、ATCC 29544）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 27660）、鼠傷寒沙門氏菌標準菌株（Salmonella typhimurium，S.TATCC 14028）；單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）、本實驗室分離的未知阪崎克羅諾桿菌（盲樣分離株） 本實驗室儲藏；兔抗阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體 北京博奧森生物技術有限公司；溶菌肉湯培養基（lysogeny broth, LB） 實驗室自行配制；阪崎克羅諾桿菌顯色培養基 上海欣中生物工程有限公司；N-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（N-（3-dimethylaminopropyl）-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC）、羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）、2-嗎啉乙磺酸（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid,MES） 分析純，美國Sigma-Aldrich公司；飽和基質CHCA（α-氰基-4-羥基肉桂酸） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司； PM3-020聚合物羧基磁珠（180 nm）磁珠 上海奧潤微納新材料科技有限公司；嬰幼兒配方奶粉（12~36月齡） 天津海關動植物與食品安全檢測中心抽檢樣。

ZHJH-C1214B垂直流潔凈工作臺、LHR-150生化培養箱、HZQX-500C恒溫振蕩培養器 浙江賽德儀器設備有限公司；AXIMA confidence MALDITOF MS質譜儀 日本島津公司；MS-12多功能磁分離架 上海奧潤微納新材料科技有限公司；BE-1100四維旋轉混勻儀 北京海天友誠科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗體制備 委托北京博奧森生物技術有限公司對4株阪崎克羅諾桿菌分離株（ATCC 29004、ATCC 12868、ATCC 29544、盲樣分離株）進行抗體制備。

1.2.2 免疫磁珠的制備 根據上海奧潤微納新材料科技有限公司AllMag?PM3-020的使用說明書活化及制備阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體免疫磁珠（CSIMB），該過程大約需要2~3 h。

1.2.3 菌懸液的制備 取適量低溫貯藏的標準菌株接種于LB液體培養基中37 ℃、220 r/min恒溫振蕩培養活化。取1 mL菌液，4000 r/min離心 10 min，棄掉上清液，用無菌生理鹽水將菌液進行梯度稀釋至實驗濃度[19]。

1.2.4 阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體特異性驗證 將阪崎克羅諾桿菌分別與大腸桿菌、沙門氏菌、單核增生李斯特氏菌及金黃色葡萄球菌以細菌濃度比為1:1進行混合后在最佳反應條件（最佳反應條件已在前期研究進行優化[19]）下反應后磁分離，去上清，將菌體-免疫磁珠復合物接種于LB液體培養基過夜培養后進行MALDI-TOF MS鑒定與分析。

1.2.5 阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體-免疫磁珠（CSIMB）捕獲率驗證 將制備好的CS-IMB分別與4株純培養的阪崎克羅諾桿菌及其混菌菌液（菌濃度約為1×103CFU/mL，4株純培養的阪崎克羅諾桿菌的比例為1:1:1:1）在最佳反應條件下反應后磁分離，待磁珠充分被吸附后取100 μL上清液接種于LB固體培養基，37 ℃恒溫過夜培養后進行菌落計數，每個樣品做3個平行，計算免疫磁珠的捕獲率，捕獲率計算公式如下。

注：C0：原菌液菌落數，CFU/mL；C1：免疫磁珠捕獲后的上清液菌落數，CFU/mL。

1.2.6 MALDI-TOF MS鑒定與數據采集分析

1.2.6.1 點樣 將磁珠捕獲后的菌體-免疫磁珠復合物經甲酸/乙醇提取法[20]處理后取1 μL上清液加至點樣靶，每種處理方法得到的樣品平行點4個孔，待樣液滴晾干后，覆蓋1 μL飽和基質CHCA，干燥后進行MALDI-TOF MS鑒定[21]。

1.2.6.2 MALDI-TOF MS數據采集與分析 采用MALDI-TOF MS對樣品進行數據采集。分析采用線性模式；激光能量：60~90 Hz；收集質荷比范圍（m/z）：2000~20000；每個樣品激光轟擊100次；采集到的數據導入島津SARAMIS數據庫進行分析。每次試驗前在采集數據的質量范圍內使用大腸桿菌ATCC 8739標準品進行校準[22]。

1.2.7 實際樣品檢測

1.2.7.1 奶粉檢測樣制備 從天津海關動植物與食品安全檢測中心抽檢樣中隨機選取3種不同品牌嬰兒配方乳粉，根據國標GB 4789.40-2016[11]進行檢測樣品處理。

1.2.7.2 奶粉檢測樣品中免疫磁珠捕獲率驗證 向處理好的奶粉樣品中分別加入細菌濃度約為1×103CFU/mL的阪崎克羅諾桿菌菌液，在最佳反應條件下反應后磁分離，待磁珠充分被吸附后取100 μL上清液接種于LB固體培養基，37 ℃恒溫過夜培養后進行菌落計數，每個樣品做3個平行，計算免疫磁珠的捕獲率。

1.2.7.3 奶粉檢測樣品中免疫磁珠特異性及檢出限研究 將4株阪崎克羅諾桿菌混菌分別與雜菌（大腸桿菌、沙門氏菌及單核增生李斯特氏菌混菌液，其中三種菌液的混合比例為1:1:1）以1:1、1:10、1:100的比例混勻后加入3種不同奶粉處理液中，在最佳反應條件下反應后磁分離，棄上清，將菌體-免疫磁珠復合物接種于LB液體培養基過夜培養后進行MALDI-TOF MS鑒定并分析。需要指出的是，由于此前對抗體特異性進行研究時發現金葡對本研究的檢測結果干擾較大，因此，該項研究并未將金葡作為干擾菌進行研究。

1.3 數據處理

每次實驗至少重復3次，應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析, 多克隆抗體效價的比較采用雙樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌抗體制備

高效價的抗體可以提高免疫檢測的特異性和靈敏性[13]，通過前期查閱分析發現，目前市場上相關的阪崎克羅諾桿菌抗體種類較少，抗體所覆蓋的菌株難以滿足本實驗的要求，因此，本單位委托北京博奧森生物技術有限公司對4株阪崎克羅諾桿菌（ATCC 29004、ATCC 12868、ATCC 29544、盲樣分離株）進行混菌抗體制備，實驗動物經四次免疫后，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）血清效價如表1所示，ATCC 29004、ATCC 12868、ATCC 29544以及盲樣分離株的效價分別為1:128000、1:128000、1:512000和1:128000，表明免疫動物血清具有較高效價，滿足后續實驗要求。對每只動物各取5 mL血清，使用ProteinA免疫親和層析進行抗體純化，已有研究表明，ProteinA純化方法親和與洗脫過程溫和，幾乎不會對抗體效價產生影響[13]。因此，本研究使用的高效價抗體可有效提高免疫磁珠的特異性和靈敏性。

表1 阪崎克羅諾桿菌混菌抗體效價測定結果Table 1 Results of antibody titer determination of Enterobacter sakazakii

2.2 阪崎克羅諾桿菌抗體特異性驗證

免疫富集技術以抗原抗體的特異性結合為基礎，因而高質量的抗體對于免疫富集的特異性與準確性具有重要意義[23]。采用免疫富集結合MALDI-TOF MS的方法，在不同菌株的干擾條件下對抗體特異性進行驗證，驗證結果如圖1所示，盡管不同樣品的細菌指紋圖譜峰值強度有所差別，但是，例如m/z約為5381、6256、9482、10288等特征峰的分布基本相同，即在不同菌株的干擾條件下，免疫磁珠富集后的檢測樣本可以經MALDI-TOF MS準確鑒定為阪崎克羅諾桿菌，說明免疫磁珠具有較好的特異性，根據MALDI-TOF MS對檢測樣品純度要求高的特點，同時也間接表明抗體具有較好的特異性，有助于提高后續檢測的特異性與準確性。但是，在鑒定過程中，出現少量的金黃色葡萄球菌鑒定結果，同時，空白對照，即未偶聯抗體的磁珠捕獲樣本也出現了金黃色葡萄球菌鑒定結果，考慮可能是由于磁珠自身非特異吸附所造成的影響[24]。

圖1 阪崎克羅諾桿菌混菌抗體特異性驗證結果Fig.1 Results of antibody specificity verification of Enterobacter sakazakii

2.3 阪崎克羅諾桿菌-免疫磁珠（CS-IMB）捕獲率研究

制備的免疫磁珠能否具有高捕獲率效果對于檢測方法的靈敏性具有重要的影響，因此，本研究對純培養條件下CS-IMB對阪崎克羅諾桿菌的捕獲率進行了研究，結果如圖2所示，在純培養條件下，免疫磁珠對于4株不同阪崎克羅諾桿菌及其混菌的捕獲率均>85%，表明免疫磁珠具有較高的捕獲率。

圖2 純培養條件免疫磁珠的捕獲率Fig.2 Capture rate of immunomagnetic beads under pure culture condition

2.4 阪崎克羅諾桿菌-免疫磁珠（CS-IMB）在奶粉基質中的捕獲率

能否在食品體系中高效捕獲目的抗原菌，對于提高檢測結果的靈敏性與準確性具有重要意義，因此，對3種不同奶粉基質中CS-IMB對阪崎克羅諾桿菌的捕獲率進行研究并取均值。結果如圖3A所示，奶粉基質中CS-IMB的捕獲率菌>80%，且檢測樣本可以經MALDI-TOF MS質譜準確鑒定為阪崎克羅諾桿菌（圖3B），盡管不同樣品的細菌指紋圖譜峰值強度有所差別，但是特征峰的分布基本相同，即CS-IMB對目的抗原菌的捕獲率及MALDI-TOF MS鑒定結果幾乎不受奶粉基質的影響。

圖3 奶粉基質中免疫磁珠的捕獲率及MALDI-TOF MS鑒定結果Fig.3 Capture rate of immunomagnetic beads in milk powder matrix and identification result of MALDI-TOF MS

2.5 不同奶粉樣品中免疫磁珠的特異性及檢出限

實際檢測工作中，檢測樣品除污染目的菌外，也可能污染其他病原菌，且污染比例有所不同，然而，目前尚未檢索到相關研究人員對高比例雜菌污染條件下免疫磁珠富集的特異性進行相關研究。因此，本研究針對3種不同奶粉樣品在不同比例雜菌（沙門氏菌、大腸桿菌、單核增生李斯特氏菌混菌）條件下進行實驗，研究免疫富集聯合MALDI-TOF MS檢測阪崎克羅諾桿菌的方法在實際樣品中的檢測特異性與檢出限。結果如圖4所示，即使在高比例（阪崎克羅諾桿菌:雜菌=1:100）雜菌污染條件下，盡管不同樣品的細菌指紋圖譜峰值強度有所差別，但是特征峰的分布基本相同，且指紋圖譜數據與數據庫比對相符率均>75%，即檢測樣品經MALDI-TOF MS準確鑒定為阪崎克羅諾桿菌。同時，檢測樣本中的阪崎克羅諾桿菌通過平板計數，結果顯示細菌濃度僅為20 CFU/mL，說明此時檢測樣本活菌濃度約為20 CFU/mL，此外，由于平板計數的局限性，該數值也存在一定誤差。

圖4 不同奶粉樣品中不同雜菌比例條件的蛋白指紋圖譜Fig.4 Protein fingerprints of different proportion of mixed bacteria in different milk powder samples

3 結論

在免疫富集聯合MALDI-TOF MS檢測中，高捕獲率及高特異性的免疫磁珠對于檢測樣本后續的準確鑒定具有重要影響，而免疫磁珠作為一種以抗原抗體特異性結合為原理的分離富集技術，其高效的捕獲效率及特異性主要取決于抗原抗體結合的親和性及特異性。因此，本研究制備了一種可同時對4株不同阪崎克羅諾桿菌具有高親和性的混菌抗體，通過對其在不同條件下的捕獲率進行驗證，結果顯示該抗體制備的免疫磁珠具有較高的捕獲率，且不受奶粉基質的影響。

此外，在實際工作中，檢測樣本往往可能存在多種致病菌的共同污染，且污染比例不一，所以，能否在復雜污染體系中準確捕獲并鑒定目的菌株，也是考驗檢測方法是否具有特異性及靈敏性的關鍵。通過對奶粉樣品在不同雜菌污染比例條件下的鑒定結果分析顯示，盡管在高比例（1:100）雜菌污染條件下，免疫富集聯合MALDI-TOF MS鑒定方法仍能對檢測樣品中的阪崎克羅諾桿菌進行準確鑒定，且此時檢測樣本中的阪崎克羅諾桿菌濃度約為20 CFU/mL，整個鑒定過程只需約24 h。與傳統方法相比，極大縮短了鑒定時間；與分子生物學方法相比[2]，克服了試劑及環境的污染；與全基因組測序方法相比，對檢測人員的技術要求不高，與單一免疫學方法相比，檢出限低至20 CFU/mL。

但是不足之處在于，該檢測方法對于抗體的特異性要求較高，且抗體制備耗時，費用高，因此，在抗體方面還有待進一步研究，同時，該方法對于檢測單位是否具備MALDI-TOF MS檢測條件也有要求。總的來說，本研究建立了一種快速簡便，特異性強，準確性高的奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測方法，為奶粉中阪崎克羅諾桿菌的有效快速檢測提供了新的方法參考。