冷吃兔常溫貯藏的風味物質變化規律

袁先鈴 ，彭先杰2，陳崇艷，萬曉玉，林洪斌

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川自貢 643000；2.成都水井坊酒業有限公司，四川邛崍 611500；3.西華大學食品與生物工程學院，四川成都 610039）

兔肉具有高蛋白、高消化率、高賴氨酸、高卵磷脂、低熱量、低脲酸、低脂肪及低膽固醇“四高四低”的特性[1]，富含硒、磷，是維生素B的重要來源，具有抗高血壓的重要功能[2]。2019年，亞洲售兔子出約6.75億只，歐洲售出約1.64億只。2020年，兔肉產業不斷上升，據統計，歐盟的生產規模為1.8億只[3]。中國是肉兔養殖大國，占世界兔肉消費量的60%[4]，主要以四川、重慶、山東、河南等地為主，占中國兔肉消費的75%。

冷吃兔是四川省自貢市的特色美食，經過腌制、炒制等步驟后冷卻，麻辣鮮香，無需加熱即可冷食，故稱之為“冷吃”。目前自貢市全力打造以冷吃兔為代表的冷吃系列美食，響應四川省“川菜出川”的號召。

冷吃兔產品通常執行的標準為GB 2726-2016，但熟肉在常溫貯藏期間受物理、化學及微生物等因素影響，對其的pH、蛋白質含量、脂肪含量等理化指標產生影響，使醛類、酮類、酯類、碳氫化合物、含硫化合物及含氮類等化合物發生改變，進而導致滋味物質及揮發性風味物質發生變化[5]。目前，對冷吃兔的研究僅僅停留在殺菌、保鮮及加工工藝等方向，未對風味物質的研究有任何深入。因此，本研究以常溫貯藏的冷吃兔為研究對象，探究冷吃兔風味物質的變化過程，為冷吃兔的工業生產標準化奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兔肉、香辛料及調味料等 購買于宜賓市天天購超市；5'-腺苷酸（5'-AMP）、5'-鳥苷酸（5'-GMP）、5'-肌苷酸（5'-IMP）、5'-二腺苷磷酸（5'-ADP）、次黃嘌呤（HX） 5種核苷酸標準品 純度100%，上海源葉生物科技有限公司；甘氨酸（Gly）、蛋氨酸（Met）、丙氨酸（Ala）、天冬氨酸（Asp）、異亮氨酸（Ile）、精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、纈氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）17種游離氨基酸標準品 分析純，純度100%，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；2-乙基丁酸標準品 純度99%，羅恩試劑；NA營養瓊脂海博生物技術有限公司。

Kjeltec 8400自動凱氏定氮儀、SoxTecTM 2055索式浸提儀 中國FOSS公司；1260 Infinity II高效液相色譜儀 美國Agilent公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；TRACETM 1300-TSQ 8000 Evo氣相色譜-質譜聯儀 美國Thermo Fisher公司；ZDJ-4A自動電位滴定儀 中國雷磁公司；101-3AB電熱鼓風干燥箱 北京中興公司；20 mL頂空進樣瓶 美國Supelco公司；Polari5 C18-A柱（250 nm×4.6 nm） 美國 Agilent 公司；VD無菌操作臺 河南秋佐儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冷吃兔的制備 冷吃兔的制備：取出內臟、毛發、筋膜、脂肪、異物和骨頭，洗凈后切成1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm大小的兔丁。

用大蒜3.75 g、生姜3.75 g、大蔥3.75 g、料酒3.75 mL、鹽1.25 g在室溫（20 ℃）下腌制兔丁20 min后待油炸。將200 mL油菜籽油加熱至200 ℃，加入腌好的兔肉500 g，炒20 min后瀝干待用。剩下的菜籽油中加入香料（80 g干辣椒、3.75 g大蒜、3.75 g姜、3 g冰糖、15 g青椒、2.5 g八角茴香、2.5 g山奈、3.75 g綠色洋蔥、1 g月桂葉、7.5 g陳皮），炒1 min。再加入瀝干的兔肉繼續炒2 min后，加入調味料（鹽1.25 g、味精1 g、雞精1 g、料酒3.75 mL、醬油4 mL），關火。

將樣品冷卻至室溫（20 ℃），裝袋抽真空，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 冷吃兔常溫貯藏時間的確定 通過菌落總數及揮發性鹽基氮（Total Volatile Basic Nitrogen,TVB-N）兩個指標來判斷冷吃兔的腐敗情況，以此確定冷吃兔常溫貯藏的時間。

菌落總數測定：參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[6]。TVB-N含量測定：參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》[7]，樣品每間隔3 d檢測一次。

1.2.3 冷吃兔常溫貯藏中理化成分的測定 樣品的水分含量測定，參考GB/T 5009.3-2016[8]中的“直接干燥法”，使用電熱鼓風干燥箱干燥至恒重后測定；樣品的蛋白質測定，參考GB/T 5009.5-2016[9]中的凱氏定氮法，經過消化后使用自動凱氏定氮儀測定；樣品的脂肪測定，參考GB/T5009.6-2016[10]，使用索式浸提儀測定。樣品的pH測定，參考馬建榮[11]的方法，使用自動電位滴定儀測定。每個樣本測量三次，樣品每間隔3 d檢測一次。

1.2.4 冷吃兔常溫貯藏中滋味物質的測定

1.2.4.1 氯化物的測定 所有樣品的氯化物測定，均參考GB/T 5009.44-2016[12]中的“銀量法”進行測定。

1.2.4.2 呈味核苷酸的測定 參考DUAN等[13]的方法，將10 g搗碎的冷吃兔肉在50 mL 5% HClO4溶液中勻漿30 s（10000 r/min），在4 ℃離心10 min（10000 r/min），重復一次，合并上清液，使用中速濾紙過濾。用1 mol/L 和0.5 mol/L NaOH調節pH至6.0，過0.22 μm濾膜后待用。樣品使用高效液相色譜法檢測。色譜條件：Polaris5 C18-A柱（250 nm×4.6 nm），檢測波長254 nm，柱溫30 ℃。流動相A為0.05 mol/L K2HPO4，B為HPLC級甲醇，A:B=95:5等梯度進樣，流速0.8 mL/min，進樣量20 μm，檢測50 min。

1.2.4.3 游離氨基酸（FAAs）的測定 參考GB/T 5009.124-2016食品中氨基酸的測定[14]：稱取0.1 g搗碎的冷吃兔肉于裝有10 mL 6 mol/L鹽酸的水解管中，滴3滴苯酚。充氮氣，抽真空，重復3次后封口。將水解管放入電熱鼓風干燥箱中110 ℃水解24 h后取出，冷卻至室溫。打開水解管，中速濾紙過濾，使用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中。取200 μL在干燥箱內減壓干燥，加200 μL的pH2.22 檸檬酸鈉緩沖溶液，過0.22 μm濾膜，使用高效液相色譜儀檢測。

1.2.4.4 非揮發性風味物質的測定分析 味精當量（Equivalent umami concentration（EUC），g MSG/100 g）是谷氨酸鈉濃度（MSG，g/100 g），由鮮味氨基酸（Asp或Glu）和5’-核苷酸（IMP、AMP和GMP）協同表示對食品的鮮味值貢獻。計算公式如下[15]：式中，EUC相當于谷氨酸鈉（g MSG/100 g）；1218：g/100 g協同系數；αi：Asp、Glu 的濃度（g/100 g）；βi：Asp、Glu相當于 MSG 的相對鮮度系數（Asp為0.077；Glu為1）；αj：5'-GMP、5'-AMP、5'-IMP的濃度（g/100 g）；βj：5'-GMP、5'-AMP、5'-IMP相對于5'-IMP的相對鮮度系數（5'-AMP為0.18；5'-IMP為1；5'-GMP為2.3）。

滋味活性值（TAV）是通過計算冷吃兔中呈味物質且貢獻顯著的計算值的。即TAV值>1，該物質對呈味有貢獻；TAV值<1，該物質對呈味幾乎沒有貢獻，由此確定呈味物質[16]。

1.2.5 揮發性風味物質的檢測

1.2.5.1 頂空固相微萃取氣質聯用（HS-SPME/GCMS）檢測 參考GUO等[17]的方法：將4 g冷吃兔肉搗碎放入20 mL頂空進樣瓶，將老化后的頂空固相萃取頭插入進樣瓶，50 ℃平衡30 min后置于進樣口200 ℃解析5 min。色譜條件：進樣口溫度200 ℃，不分流進樣，色譜柱為DP-WAX，載氣流速1 mL/min，柱溫箱初始溫度為40 ℃，最終溫度為200 ℃。質譜條件：離子源溫度為280 ℃，傳輸線溫度為260 ℃，掃描范圍30~550 m/z。

定性分析：在普庫（NIST11、NIST11s）對化合物的質譜進行鑒定，記錄匹配度大于等于80的化合物。定量分析：在頂空固相微萃取前加入40 μL 0.2 μg/mL 2-乙基丁酸作為內標，采用面積歸一化法計算各化合物的相對濃度，公式如下，

式中：Ci為各風味物質的相對濃度（μg/kg）；Si為各物質的峰面積；S標為內標物的峰面積；mi為樣品質量（kg）；m標為內標物質量（μg），本實驗內標物的質量為4.0 μg。

1.2.5.2 氣味活性值（OAV）的計算分析 氣味活性值能表述風味化合物的貢獻大小。通過將測定的濃度除以它們各自的氣味閾值來計算關鍵氣味的OAV[18]。公式如下：

式中： Ci為風味物質i的相對濃度（μg/kg），Ti該風味物質i的嗅覺閾值（μg/kg）。當0≤OAV<1，說明該風味物質對總體風味無實際作用，對炭烤羊腿風味具有一定的修飾作用；OAV≥1，說明該風味物質可能對總體風味有直接影響，被確定為炭烤羊腿中特征風味物質；OAV值越大說明該組分對總體風味貢獻越大。

1.3 數據處理

實驗結果通過Excel 2013 對數據進行統計分析，將各個指標用SPSS進行方差分析（ANOVA），用多重比較法分析差異顯著性，其中P<0.05表示差異顯著[19]。使用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 常溫貯藏的腐敗時間

菌落總數是判定食品受細菌污染的程度和檢測衛生質量的標準[20]（國標中菌落總數≤105CFU/g[21]）。TVB-N是動物性食品在酶和細菌的作用下，分解蛋白質產生氨及胺類等堿性含氮物質（國標中TVBN含量需≤35 mg/100 g[7]）。由表1可知，菌落總數與TVB-N在15 d顯著增加（P<0.05），超過國家標準。因此，探究冷吃兔在貯藏過程中風味物質的變化，將15 d作為實驗終點。

表1 冷吃兔常溫貯藏的菌落總數及TVB-N含量Table 1 Total number of colonies and TVB-N in cold-eating rabbits stored at room temperature

2.2 常溫貯藏過程中的理化成分變化規律

食品中的水分含量能有效影響食品的性質，并與蛋白質、脂肪等非水組分通過一定的方式相互作用[22]。蛋白質不但能影響肉制品硬度，還能被降解成多肽及硫氨基酸進而影響風味物質的產生[23]。脂肪在貯藏中發生氧化及水解等反應，能產生醛類、酮類等，使產品的風味物質收到改變。pH能影響半胱氨酸與還原糖反應中風味物質的形成[24]，使產品的品質發生變化。

冷吃兔在常溫貯藏中的水分、蛋白質、脂肪及pH含量如圖1所示。在0~15 d，水分含量范圍為20.98%~27.85%。水分含量變化顯著（P<0.05），可能是微生物對水分進行充分的利用，總體水分含量較高，有益于微生物的繁殖。蛋白質含量為25.15%~27.9%，脂肪含量為24.06%~27.21%，其中，蛋白質及脂肪含量顯著降低，均降低了2.47%（P<0.05），可能是由于蛋白質及脂肪氧化或降解等反應所造成的，與臘肉貯藏期間發生蛋白質及脂肪氧化相類似[25]。pH由0 d貯藏時的6.09增加到3 d的6.11，再顯著下降至9 d的5.92（P<0.05），之后又呈上升趨勢。pH下降的主要原因可能是蛋白質的氧化能產生羰基化合物進而繼續氧化成酸類物質[26]，亦或者是菌分解碳水化合物產酸使pH降低。之后pH升高，可能是細菌繁殖產生的蛋白酶將蛋白質分解成呈堿性的胺類物質[27]。

圖1 冷吃兔常溫貯藏中理化指標的變化Fig.1 The changes of physical and chemical indexes in coldeating rabbit at room temperature storage

2.3 常溫貯藏過程中的滋味物質變化規律

2.3.1 冷吃兔常溫貯藏過程中氯化物含量及TAV值分析 氯化物是食品中重要的咸味貢獻者，能與游離氨基酸或核苷酸等其他物質協同作用產生風味物質。如表2所示，氯化物的含量在0~6 d顯著增加（P<0.05），在9~15 d顯著下降（P<0.05）。在6 d時，含量達到最高，為1.19 g/100 g，可能是隨著水分含量的降低，且氯化鈉不斷地滲透，使其含量增加。脂肪阻止氯化物的遷移，使其含量降低[28]。氯化物的含量均在閾值之上，能有效呈現出咸味。

表2 常溫貯藏過程中氯化物含量及TAV值Table 2 Chloride content and TAV value during storage at room temperature

2.3.2 常溫貯藏過程中核苷酸分析 不同呈味核苷酸的呈鮮味效果不同，其對肉品鮮味的貢獻度主要取決于呈味強度值。研究發現，具有鮮味特征的核苷酸及其衍生物為30多種芳香雜環化合物，以5’-肌苷酸、5’-鳥苷酸和5’-腺苷酸三種為代表，當核糖中出現5’位碳原子上具有磷酸基團、嘌呤中6’位碳原子上具有一個羥基或鮮味核苷酸均為嘌呤類時，核苷酸具有呈鮮味的特性[30]。

由表3可知，常溫貯藏條件下冷吃兔中的主要呈鮮味核苷酸是5’-IMP，在3 d時達到最大值40.65 mg/100 g，是冷吃兔的特征滋味物質，之后降低14.35 mg/100 g。結合TAV值，由1.63降至1.05，但依舊是鮮味的主要貢獻者，與大黃魚中有較高含量的IMP結果相似[31]，可能是由于5’-IMP穩定性最差，易分解[32]。5’-GMP也在略微下降，兩者下降的原因可能是通過ATP在酶的作用下發生降解或者隨著核苷酸底物的消耗導致的，這與雞肉在常溫階段中呈味核苷酸的變化類似[33]。隨著貯藏時間的延長，呈甜味氨基酸5’-AMP及呈苦味氨基酸HX在0~6 d無顯著變化（P>0.05），15 d時增加。其中5’-GMP 、5’-AMP、5’-ADP及HX的TAV均<1，對冷吃兔的風味幾乎沒有影響或影響很小。根據核苷酸的總含量可以看出，在常溫貯藏期間，呈味核苷酸呈下降趨勢且顯著（P<0.05），在0~6 d中無明顯變化，9 ~12 d中無明顯變化。因此，可將貯藏6 d作為呈味核苷酸變化的關鍵時間點，此時鮮味呈現效果最明顯。

表3 貯藏過程中的呈味核苷酸含量及TAVTable 3 Taste nucleotide content and TAV in the storage process

2.3.3 常溫貯藏過程中游離氨基酸分析 游離氨基酸對風味物質有重大的影響。從表4得出，冷吃兔中的游離氨基酸含量降低。結合TAV值，游離氨基酸總TAV呈顯著降低趨勢（P<0.05），其中，鮮味氨基酸的TAV降低最劇烈，由10.73降低至3.89，在0 d時TAV最大，3~6 d時，無明顯變化，之后顯著降低（P<0.05），其中，Glu在3~15 d下降最顯著（P<0.05），降低了5.69，可能其受到分解，導致貯藏過程中鮮味降低的重要原因。Glu是冷吃兔的主要呈鮮味氨基酸，在貯藏期間TAV均>1，保持了冷吃兔具有特征鮮味的特性。Asp的TAV在3~15 d降低了0.29，始終小于1，即在冷吃兔貯藏期間無鮮味貢獻或貢獻較小。Glu與Asp的降低可能是因為氨基酸降解或與其他物質作用導致。甜味氨基酸含量的TAV在0~6 d增加了0.32后降低0.62，在6 d達到最大值，可能是蛋白質在該條件下熱解生成氨基酸及肽類。而苦味氨基酸在貯藏期間增加了2.23，其中，15 d增加顯著（P<0.05）。

表4 常溫貯藏過程中游離氨基酸的TAVTable 4 TAV of free amino acids during storage at room temperature

2.3.4 冷吃兔常溫貯藏過程中滋味活性值變化（EUC）由表5可知，結合MSG滋味閾值（30 mg/100 mL），隨著貯藏時間的延長，冷吃兔的滋味活性值均高于MSG鮮味閾值。即Asp、Glu與5'-IMP、5'-AMP與5'-GMP協同作用使冷吃兔的呈鮮味增強。0~15 d間顯著降低了14.33 gMSG/100 g（P<0.05），在0 d時達EUC最大為19.49 gMSG/100 g，0~6 d內EUC減少不顯著（P>0.05），9~15 d降低顯著（P<0.05）。結合EUC，可將6 d作為冷吃兔滋味流失的關鍵時間點。

表5 冷吃兔常溫貯藏過程中的EUC值Table 5 EUC value of cold-eating rabbit during storage at room temperature

2.4 常溫貯藏過程中的揮發性風味物質變化規律

如表6可知，通過HS- SPME/GC-MS對常溫貯藏期的冷吃兔的風味進行檢測。隨著貯藏時間的進行，共檢測出10大類62種化合物，分別檢測風味物質種類如表7?；衔锓N類在0~6 d增加，6~15 d降低，其中檸檬醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛、十六醛、芳樟醇、芐醇、苯乙醇、茴香腦、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等特征風味物質含量都降低（P<0.05），可能是因為油脂的酸敗等導致冷吃兔的特征風味物質明顯降低。將0 d與6 d對比發現，檢測出的風味物質種類及相對含量最相似。共檢測出19種化合物貫穿于貯藏期間，其中芳樟醇與茴香腦的含量最高。

表6 冷吃兔常溫貯藏過程中的風味物質含量Table 6 Flavor substance content of cold-eating rabbit during storage at room temperature

表7 冷吃兔常溫貯藏過程中的風味物質種類Table 7 Types of flavor substances in cold-eating rabbits during storage at room temperature

醛類化合物主要來源于脂肪的氧化降解及酶或微生物的氧化所形成，是熟制品的主要風味化合物。在檢測到的8種醛類中，壬醛、反式-2-癸烯醛、檸檬醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛及十六醛一直存在于貯藏期中，呈顯著降低趨勢（P<0.05）。其中，壬醛的含量最高，其次是十六醛。醇類主要由肌肉中的共軛亞油酸被脂肪氧合酶和氫過氧化酶降解產生。在檢測到的11種醇類中，芳樟醇、（-）-4-萜品醇、alpha-松油醇及苯乙醇是共同存在的，隨著貯藏時間的延續，它們的含量呈顯著下降趨勢（P<0.05）。其中芳樟醇的含量最高，其次為（-）-4-萜品醇。酸類化合物是一般脂肪氧化降解為低級脂肪酸產生[34]。其中，辛酸、硬脂酸及棕櫚酸酸一直存在于貯藏期。棕櫚酸的含量最高，其次為硬脂酸，可能是硬脂酸為飽和脂肪酸，因分子內不存在雙鍵而比較穩定，不易被氧化。萜類中姜烯的含量較高，也是姜粉中為主要揮發性風味物質[35]。醚類中，茴香腦的含量較高，與張麗珠等[36]研究棕櫚油與菜籽油復合火鍋底料中檢測出高含量的芳樟醇與茴香腦的結果相似。

續表 6

3 結論

冷吃兔在常溫貯藏期間，氯化鈉的含量均在閾值之上，能有效呈出咸味。鮮味氨基酸中Glu下降最顯著（P<0.05），但TAV均>1，使冷吃兔保持了特征鮮味。主要呈鮮味核苷酸是5’-IMP，依舊是鮮味的主要貢獻者，5’-GMP 、5’-AMP、5’-ADP及HX的TAV均<1，對冷吃兔的風味幾乎沒有影響或者影響很小。根據核苷酸的總含量可以看出，貯藏6 d是呈味核苷酸變化的關鍵時間點。結合MSG滋味閾值（30 mg/100 mL），隨著貯藏時間的延長，冷吃兔的滋味活性值均高于MSG鮮味閾值。即Asp、Glu與5'-IMP、5'-AMP與5'-GMP協同作用使冷吃兔的呈鮮味增強。結合EUC，冷吃兔常溫貯藏中滋味物質一直降低，9~15 d降低顯著（P<0.05），0~6 d無明顯變化，因此，可將常溫貯藏第6 d作為冷吃兔滋味流失的關鍵時間點。揮發性風味物質風味共檢測出10大類62種化合物。其中，與0 d進行對比得出在第6 d時檢測出的風味物質種類及相對含量最相似，共檢測出19種化合物貫穿于貯藏期間，其中芳樟醇與茴香腦的含量最高。

綜上所述，冷吃兔在常溫貯藏6 d后，滋味物質及揮發性風味物質出現明顯的變化，6 d前食用常溫貯藏的冷吃兔具有較好的風味。