草莓灰霉菌拮抗菌的誘變篩選和有效抑菌成分分析研究

趙慧軍，賈國軍，吳雄斌，馬金琳

(蘭州職業技術學院， 甘肅蘭州730000)

一、引言

草莓灰霉病是由半知菌亞門、叢梗孢目、叢梗孢科、葡萄孢屬的灰葡萄孢菌侵染引起的植物病害，由于其宿主廣泛、致病性強，可以導致水果莖葉、果實的枯萎、腐爛[1]，嚴重影響水果的產量及其品質。

國內外的研究表明，當前對草莓灰葡萄孢菌的防治方法和手段措施種類繁多且較為復雜。其中化學防治依然占據主導地位，雖然具有見效快、殺菌效果好等優勢，但其不可避免存在導致諸如誘發抗藥性菌株的突變，農藥殘留對種植園土壤、水體和其他環境因素的污染，尤其是化學藥劑直接用于水果防腐保鮮，化學殘留勢必會影響和危害身體健康[1]。由此可見，水果病蟲害生物防治及研發有機試劑用于水果防腐保鮮就具有極大的優勢和市場潛力。

甘肅省蘭州市紅古區是蘭州市綠色農產品產業化示范區，土壤氣候條件適合多品種草莓種植。本項目通對紅古區花莊鎮草莓標準化生產基地的調查采樣，從蘭州市花莊鎮河咀村草莓種植基地灰霉病高發區病果根際土壤篩選到一株枯草芽孢桿菌，經抑菌實驗發現其對灰霉菌有一定的抑制作用。通過人工誘變的方法在原來基礎上選育抑菌能力更強的生防細菌，并通過對發酵液中抑菌活性物質進行分離純化，對草莓灰霉菌拮抗菌抑菌成分進行定性分析研究。

二、材料與方法

(一)供試菌種

實驗中植物病原菌草莓灰葡萄孢菌(Botrytis sp.isolate NO_9)由項目團隊從紅古區花莊鎮河咀村溫室大棚(103°07′23.93″E，36°12′16.36″N)種植的草莓病果(未采摘)、感染灰霉菌的草莓葉片、冷庫中儲存的草莓腐敗果實中分離鑒定保藏(已經通過形態學和分子生物學鑒定，為草莓灰葡萄孢菌)。拮抗菌HZ12從上述采樣區草莓病果、草莓植株根際土壤分離純化保藏(已經通過形態學和分子生物學鑒定，為枯草芽孢桿菌)。

(二)試劑

PDA培養基；斜面培養基：牛肉膏蛋白胨固體培養基；液體搖瓶培養基：液體肉湯培養基。硫酸二乙酯(DES),亞硝酸。

(三)試驗方法

1.硫酸二乙酯誘變

致死率的測定：將經過活化的出發菌株轉接至牛肉膏蛋白胨培養基進行搖床培養，設置30℃、180 rpm/min恒溫震蕩培養12 h，5000 rpm/min離心10 min，棄上清，Ph6.0的磷酸緩沖液洗滌沉淀3次，制備成1ⅹ108 CFU/mL的菌懸液。從中取出10 mL的菌懸液，分別加入5μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μlDES，形成6個濃度梯度：0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，以不加DES為空白對照。28℃、180rpm/min恒溫震蕩培養40 min，然后向菌懸液中加入1mL2%的硫代硫酸鈉，終止誘變反應。稀釋菌懸液，涂布平板，每個處理涂布三個平板，37℃恒溫培養48h，統計菌落數，計算致死率。

2.突變株的篩選

對菌株HZ12進行DES誘變處理，作用時間10min，挑選單菌落，將誘變獲得的25個菌株進行發酵培養。

初篩：將誘變處理的菌株在20 mL液體搖瓶中發酵培養2 d，離心收集上清液，將上清液(100 mL)與等量灰霉孢子懸液混合[2]，28℃萌發8h后計算萌發率，對菌種進行初篩。

復篩：將上述篩選的菌株進行斜面培養，待菌株成熟后接種搖床發酵培養，制備發酵液進行抑菌實驗，檢測其抑菌性。

突變株穩定性試驗：為測試誘變得到的突變株穩定性，將誘變后得到的兩株突變株在細菌培養基上進行連續傳代5次，將傳代的菌株進行發酵培養，制備發酵液進行抑菌實驗，檢測其抑菌性。

3.草莓灰霉孢子懸液的制備

將上述分離純化篩選出的灰葡萄孢菌接種PDA平板，25℃恒溫培養5 d，確保培養箱濕度(相對濕度90%)，平板菌絲生長良好，附著大量孢子(顏色暗灰色)即可。0.3%吐溫80滅菌水溶液反復洗脫培養皿，收集灰霉孢子，用無菌水調整其濃度為1.0x106個/mL備用。

4.有效抑菌物質的定性研究

將草莓灰霉菌拮抗菌株HZ12進行搖床發酵培養，150 rpm/min、37℃恒溫搖床48 h后，制備處理發酵產物，對其發酵液進行4000 rpm/min離心30 min，分離上清液I備用，沉淀為拮抗菌菌體，用PBS離心洗滌2次、無菌水離心洗滌1次后備用[3]。

無菌水制備拮抗菌菌懸液，進行細胞破碎處理(采用間歇破碎：細胞破碎2s，間歇2s，持續10 min)，靜置待出現上清液，4000 rpm/min離心30 min，分離上清液II備用，收集沉淀，用無菌水稀釋制備懸濁液III[4]。

分別測定不同物質的抑菌活性(杯碟法)：15 cmPDA培養皿間隔(等間距)放置3個牛津杯[5]，杯中分別加入100μl上清液I、上清液Ⅱ、懸濁液III，培養箱25℃恒溫培養48 h后測其抑菌圈。

EP管中分別加入清液I、上清液Ⅱ、懸濁液III、液體培養基3 mL，再加入上述制備的灰霉孢子懸液2 mL，恒溫培養箱28℃培養8 h，將EP管內懸濁液混合均勻后，取樣置于計數板上，計算灰霉孢子萌發率。

三、結果與討論

(一)最佳誘變濃度的選擇

見表1所示，DES濃度的增加，菌群致死率逐漸增加。參考文獻資料顯示，選擇致死率為70%-80%的誘變處理濃度作為最佳的誘變濃度，因此選擇DES的最佳誘變濃度為0.1%。

表1 DES濃度與菌群致死率的關系

(二)突變株的篩選

通過抑菌圈可以發現，得到的兩株突變菌通過傳代培養后HZ12-13、HZ12-17對灰霉具有穩定的抑制作用，且該菌株能穩定遺傳，未出現菌株退化的現象(見圖1-圖4)。

圖1 菌株HZ12-13菌落 圖2 菌株HZ12-17菌落

抑菌圈如圖3、圖4所示：

圖3菌株HZ12-13拮抗試驗 圖4菌株HZ12-17拮抗試驗

(三)拮抗菌不同成分對草莓灰葡萄孢菌的抑菌作用

采用杯碟法檢測上清液I、上清液Ⅱ、懸濁液III對草莓灰葡萄孢菌的抑制作用，以無菌水為對照，菌株HZ12-13和HZ12-17具有較強的抑菌作用(見圖5、圖6)；發酵液抑菌試驗培養2d后，抑菌圈直徑均在16-24mm，抑菌效果較為穩定(見表2)。

表2 拮抗菌對灰霉菌的生長抑制作用

圖5菌株HZ12-13拮抗實驗 圖6菌株HZ12-17拮抗實驗

(四)拮抗菌不同成分對草莓灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制作用

見表3所示，添加了上清液I的灰霉孢子萌發率最低。

表3 拮抗菌對灰霉孢子的萌發抑制作用

初步認為，枯草芽孢桿菌對灰霉菌的拮抗物質主要有兩類：細胞發酵產物(胞外分泌物)、細胞體(細胞內容物或細胞結構成分)，采用超聲波破碎主要是將枯草芽孢桿菌菌體裂解，細胞破碎，使其細胞內物質釋放出來[6]，溶解(懸浮于)上清液Ⅱ(或懸濁液III)。實驗中以細胞培養基為對照，以排除培養基對孢子萌發的影響。實驗發現，細菌培養基不能抑制或干擾灰霉菌孢子萌發，其營養成分可滿足灰霉孢子的萌發和生長。因此，拮抗菌發酵產物其胞外分泌物可有效抑制灰霉孢子的萌發，這對后續研究草莓灰霉病的防治和防腐保鮮具有重要意義和應用價值。