菱角殼黃酮類化合物的提取工藝優化及抑菌活性研究

鄧麗娜 張疏璇 鄭清 張楷歆

摘 要：采用乙醇提取法對菱角殼中黃酮類化合物進行提取，以黃酮類化合物提取率作為指標，經正交實驗獲得菱角殼中黃酮類化合物提取的最佳工藝。結果表明，乙醇體積分數65%，液料比1∶20，提取溫度70℃，提取時間85min時，提取率為3.78%。抑菌試驗發現菱角殼中黃酮類化合物提取物對尖孢鐮刀菌、禾谷鐮孢菌、灰葡萄孢菌病原菌的菌絲生長均有抑制效果，對灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮孢菌菌絲生長的抑制率分別達到29.41%、23.52%、29.41%。

關鍵詞：菱角殼;黃酮類化合物;抑菌活性

中圖分類號 R284.2 文獻標識碼 B 文章編號 1007-7731（2022）03-0108-04

Abstract： The flavonoids in Trapa bispinosa Roxb. shell were extracted by ethanol. The flavonoid content was used as the index to obtain the optimum extraction technology of flavonoids in Trapa bispinosa Roxb. shell. The results of orthogonal experiment showed that the extraction rate of total flavonoids reached 3.78% when the concentration of ethanol was 65%， the ratio of material to liquid was 1：20， extraction conditions was 70℃ and the extraction time was 85 min. Through antifungal test， it was found that the flavonoids in Trapa bispinosa Roxb. shell had inhibitory effect on hyphal growth of Botrytis cinerea， Fusarium graminearum， Fusarium oxysporum. It was found that the inhibition rate of hyphal growth of Botrytis cinerea， Fusarium oxysporum and Fusarium graminis reached 29.41%， 23.52% and 29.41%， respectively.

Key words： Trapa bispinosa Roxb.shell; Flavonoids; Antifungal activity

1 引言

菱角（Trapa bispinosa Roxb）為一年生草本水生植物，又名腰菱，菱實，水栗[1]。菱角皮脆肉美且含有豐富的營養成分，但是食用果實后剩余的菱角殼被大量丟棄，對環境造成了一定的負面影響[2]。據報道，目前研究者已從菱角殼中提取出多種天然活性成分，有甾醇類、黃酮類、生物堿類、多糖類等，研究證實它們均具有一定的藥理作用[3-6]。現對菱角殼的研究多為其活性成分提取以及藥理作用方面的研究，而對其在抑菌方面的研究相對較少。

植物病害是造成農業生產作物損失的重要原因之一，而真菌是引起各類植物病害的重要病原物之一。目前為了提高作物生產力和質量，農業生產依然無法擺脫對化肥和農藥的依賴。近年來的研究表明，天然黃酮類物質能提高植物對病毒、真菌、細菌、線蟲等抗性[7-8]。隨著人們環保意識和食品安全意識的提升，人們對安全、有效的農藥替代品需求日益增加，而植物源抑菌農藥已經成為目前的研究熱點[7]。本實驗擬以菱角殼為材料，通過單因素和正交試驗對菱角殼中黃酮類化合物的提取工藝進行優化，并研究黃酮類化合物提取物對幾種植物病原菌的抗菌活性，為菱角殼資源的合理利用提供理論依據，同時為發現植物源殺菌劑提供線索，以期對有害生物的防治發揮重要作用。

2 材料與方法

2.1 試驗材料 菱角，采自鹽城市董大水生蔬菜專業合作社。蘆丁標準品，亞硝酸鈉，硝酸鋁，無水乙醇，氫氧化鈉，土豆，葡萄糖，純化瓊脂，灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum），尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）等。粉碎機，干燥箱，旋轉蒸發儀，可見分光光度計，水浴加熱鍋、超聲破碎儀、高壓蒸汽滅菌鍋、電熱爐、移液槍、菌片打孔器等。

2.2 試驗方法

2.2.1 樣品的制備 取一定量的菱角殼，放入60℃電熱鼓風干燥箱中烘干至恒重，用萬能粉碎機粉碎后過50目篩，將菱角殼粉分別裝入干燥器保存備用。

2.2.2 標準曲線的制定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[9]，按照上海源葉生物有限公司提供的蘆丁標準品制備標準曲線，準確稱取37.5mg蘆丁標準品于30mL容量瓶中，用無水乙醇定容。分別吸取該蘆丁標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0置于25mL的容量瓶中，各容量瓶中加入乙醇至12.5mL，再分別加入5%NaNO2水溶液0.7mL，搖勻后靜置5min;加入10%Al（NO3）3溶液0.7mL，搖勻，靜置6min;再分別加入lmol/L NaOH水溶液5mL，加入無水乙醇至25mL，靜置10min后于可見分光光度計510nm處測量吸光度。得到蘆丁標準曲線為：Y=0.8664X+0.0036（R2=0.99），蘆丁在0.05～0.35mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 測定指標 采用傳統的乙醇提取法提取菱角殼中黃酮類化合物[9]，通過單因素試驗初步確定料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數4因素水平。代入標準曲線方程計算菱角殼中黃酮類化合物的濃度，根據公式（1）計算樣品中黃酮類化合物提取率[9]。

樣品中黃酮類化合物提取率%=C×V/W×103×100 （1）

其中C：黃酮類化合物濃度，mg/mL;V：樣液總體積，mL;W：菱角殼粉的質量，g。

依據單因素試驗結果，分別選擇料液比（A）、乙醇體積分數（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）這4個因素，設計適宜范圍內的3個不同水平，如表1所示L9（34）進行正交實驗。

2.2.4 抑菌試驗 抑菌活性測定采用抑制菌絲生長速率法[10]，取黃酮類化合物提取液1mL涂布于PDA培養基上，以無菌水涂布為空白對照，分別接種3mm的灰葡萄孢菌、禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌的菌片進行培養，將各平板倒置放入26～28℃恒溫培養箱中觀察其生長情況。根據公式（2）、（3）測定抑菌活性。

病原菌菌落直徑=測量直徑平均值-3mm （2）

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照組菌落直徑×100 （3）

3 結果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 料液比對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響 由圖1可知，料液比在1∶15～1∶25（g：mL）的范圍時，黃酮類化合物提取率逐漸增加;當料液比達到1∶25（g：mL）時，黃酮類化合物提取率達到2.71%，當料液比繼續增大時，黃酮類化合物提取率趨于穩定，分析原因可能是當物料比達到1∶25時，黃酮類化合物已經基本溶出，達到最大溶解量。由此選取最佳料液比為1∶25（g：mL）。

3.1.2 乙醇提取分數比對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響 由圖2可知，隨著乙醇體積分數的增加，黃酮類化合物提取率先增高后降低;當乙醇體積分數為70%時，黃酮類化合物的提取率達到3.33%;隨著乙醇體積分數繼續增加，黃酮提取率反而降低。分析可能是部分黃酮類化合物是水溶性的，過高濃度的乙醇影響水溶性黃酮類化合物的溶解。因此選取最佳乙醇體積分數為70%。

3.1.3 提取溫度比對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響 由圖3可知，隨著提取溫度的升高，黃酮類化合物粗提物的提取率呈現出先增加后降低的趨勢;當提取溫度達到75℃時，黃酮類化合物提取率達到3.20%;隨著提取溫度繼續升高，黃酮類化合物提取率出現了降低的趨勢，原因可能是當溫度過高易破壞了一些黃酮類化合物的結構，從而導致菱角殼的黃酮類化合物提取率降低。因此選取最佳提取溫度為75℃。

3.1.4 提取時間比對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響 由圖4可知，在70～80min范圍內隨著提取時間的增加，黃酮類化合物的提取率提高，提取時間為80min時提取率達到2.54%;當提取時間繼續增加時，黃酮提取率出現下降趨勢。其原因可能是隨著提取時間延長，黃酮的穩定性降低，雜質易析出，導致提取率降低。因此選取最佳提取時間為80min。

3.2 正交試驗 通過正交試驗分析可知（表2），各因素對菱角殼黃酮類化合物提取率的影響大小依次為乙醇體積分數（B）>液料比（A）>提取溫度（C）>提取時間（D）。最優提取條件為B1A2C1D3，即提取條件為乙醇體積分數65%，液料比1∶20，提取溫度70℃，提取時間85min時，黃酮類化合物的提取率最高。為進一步考察上述優選工藝的穩定性，采用上述的最佳提取條件，取3份質量為5.000g的菱角殼粉樣品，進行乙醇提取法并計算黃酮類化合物提取率。得到總黃酮的平均提取率為3.78%。

3.3 抑菌試驗結果 以無菌水涂布為空白對照，發現菱角殼提取的黃酮類化合物對灰葡萄孢、禾谷鐮孢菌和尖孢鐮刀菌的菌絲生長均表現出不同程度的抑制（表3）。當空白對照組的3種菌落的菌絲長滿平板時，觀察可發現菱角殼中黃酮類化合物提取物對灰葡萄孢菌和尖孢鐮刀菌抑制效果較好（圖3-5）。由菌絲生長抑制率測定值可知，菱角殼提取出的黃酮類化合物對灰葡萄孢菌和尖孢鐮刀菌抑制率均達到29.41%，對禾谷鐮孢菌抑制率為23.52%。

4 結論

以菱角殼黃酮類化合物的提取率為考察指標，優化最佳的提取工藝參數為：乙醇體積分數65%，液料比1∶20，提取溫度70℃，提取時間85min，得到黃酮類化合物的提取率為3.78%。已有文獻表明菱角殼的提取物具有一定的抑菌活性[11-12]，而本試驗進一步證實菱角殼的黃酮類化合物對3種植物病原真菌有一定的抑制效果，對灰葡萄孢菌和尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制率均達到29.41%，而其中的抑菌活性成分的分離純化、田間藥效、作用機理等尚待深入探討。本研究結果表明，菱角殼中黃酮類化合物物質是潛在的天然植物抑菌劑，可為植物病原菌抑菌劑的研發提供理論依據，對生物防治起到推進作用。

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（責編：王慧晴）

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