等離子體處理對(duì)4種草莓病原真菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

關(guān)兆英，馬玉超，龐婧珺，孫運(yùn)金，閆 哲*，尚巧霞*

(1.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院首都農(nóng)產(chǎn)品安全產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院等離子體工程中心，北京 102206)

草莓(Fragariaspp.)為薔薇科草莓屬多年生草本植物[1]。由于其形美味甜，且富含氨基酸、礦物質(zhì)及維生素C等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。近年來(lái)，中國(guó)草莓栽培面積逐年擴(kuò)大，但草莓根腐病、枯萎病、炭疽病、灰霉病等病害在生產(chǎn)中時(shí)常發(fā)生[3]，如果防治措施不得當(dāng)或不及時(shí)，可能會(huì)嚴(yán)重影響草莓產(chǎn)量和品質(zhì)。已報(bào)道的草莓根腐病的病原菌達(dá)20多種，主要有鐮孢屬Fusarium、炭疽菌屬Colletotrichum、絲核菌屬Rhizoctonia等真菌，其中由立枯絲核菌Rhizoctoniasolani引起的草莓根腐病是影響草莓生產(chǎn)的重要病害之一，發(fā)病初期從幼根前端或中部變成褐色或黑褐色，不定根的中間部位表皮壞死，病健交界明顯，被侵染的植株長(zhǎng)勢(shì)弱，葉片變黃，分蘗減少，結(jié)果減少，嚴(yán)重時(shí)維管束褐變、壞死，整株植株萎蔫，最后枯死[4]；草莓枯萎病是由尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum引起的，發(fā)病的草莓植株心葉黃化，伴有畸形葉產(chǎn)生，輕者導(dǎo)致病株生長(zhǎng)衰弱，結(jié)果率低，果實(shí)瘦小，果實(shí)口感變差，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致匍匐莖減少，整株枯萎至死亡[5]；草莓炭疽病的病原菌主要為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，在草莓育苗期和移栽存活期發(fā)病最嚴(yán)重，常常危害短縮莖、匍匐莖和葉柄，造成大量爛苗、死苗現(xiàn)象[6]；草莓灰霉病是由灰葡萄孢菌Botrytiscinerea引起的草莓開(kāi)花結(jié)果期和采后的重要病害，該病可以危害花器和果實(shí)，也可危害葉片，受危害的花器和果實(shí)腐爛，受害的葉片呈“倒V字”形[7]。目前草莓病害防治仍以化學(xué)防治為主[8]，可持續(xù)的綠色農(nóng)業(yè)綜合防治措施有待完善。等離子體技術(shù)作為一項(xiàng)現(xiàn)代物理技術(shù)，具有處理速度快、操作簡(jiǎn)單、殺菌高效和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，可殺死多種類(lèi)型的抗性細(xì)菌細(xì)胞、真菌類(lèi)病原菌、芽孢、病毒和酵母菌等[11]，還能激發(fā)種子的萌發(fā)潛能，提升種子的生命活力，提高產(chǎn)量和質(zhì)量[12]，近年來(lái)越來(lái)越廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，但是在植物病害防治上應(yīng)用較少。鑒于此，該研究利用等離子體技術(shù)，對(duì)4種常見(jiàn)的草莓病原真菌：灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides的抑菌效果和敏感性進(jìn)行測(cè)定，旨在了解、探索等離子體處理對(duì)草莓真菌病害的防治潛力，為科學(xué)合理的利用等子體技術(shù)防治植物病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試病原真菌 灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，這4種草莓病原真菌均由北京農(nóng)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供，選用PDA培養(yǎng)基，經(jīng)活化培養(yǎng)后于4 ℃冰箱中保存。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 放電等離子體由北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院自制，如圖1所示[13]。

注：1是樣品放置臺(tái)；2是電子噴射口；3是距離刻度線，由下至上為0-7 cm；4是電介質(zhì)管；5和6是正負(fù)直流電壓；7是功率顯示屏；8是功率調(diào)節(jié)器；9是開(kāi)關(guān)。Note: 1 is the sample placement table; 2 is the electron injection port; 3 is the distance scale, which is 0-7 cm from bottom to top; 4 is the dielectric tube; 5 and 6 are positive and negative DC voltages; 7 is the power screen; 8 is the power regulator; 9 is the switch.圖1 放電等離子體示意圖Fig.1 The schematic diagram of plasma

1.2 試驗(yàn)方法

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[14]測(cè)定等離子體處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。用直徑5 mm滅菌打孔器，分別在活化后的4種草莓病原真菌菌落邊緣打孔，并將菌餅接種于PDA平板上，再將平板放置在等離子體的樣品放置臺(tái)上，在室溫、空氣的條件下，將等離子體調(diào)節(jié)放電功率400 W，處理1、3、5和7 min，重復(fù)3次，以不進(jìn)行處理作為空白對(duì)照。放入28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～5 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[15]。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100.00%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

菌落擴(kuò)展直徑和菌絲生長(zhǎng)抑制率用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。將菌絲生長(zhǎng)抑制率轉(zhuǎn)換成抑制幾率值(y)，等離子體處理時(shí)間(min)轉(zhuǎn)換成質(zhì)量時(shí)間對(duì)數(shù)(x)，計(jì)算毒力回歸方程：y=ax+b(a表示回歸系數(shù)，b為常數(shù))，并以回歸方程計(jì)算等離子體處理對(duì)4 種草莓病原真菌的半數(shù)致死時(shí)間(LT50) 及相關(guān)系數(shù)(R)。

2 結(jié)果與分析

2.1 等離子體處理對(duì)4種草莓病原真菌的抑制率

等離子體處理7 min，對(duì)4種草莓病原真菌均具有顯著的殺菌作用(表1)，4種草莓病原真菌的菌落擴(kuò)展直徑都為0.00 cm，抑制率為100.00%。而另外3個(gè)等離子體處理時(shí)間對(duì)4種草莓病原真菌也具有不同程度抑制菌絲生長(zhǎng)的作用，且處理的草莓病原真菌菌落擴(kuò)展直徑均小于對(duì)照。其中等離子體處理1 min，對(duì)4種草莓病原真菌的抑制效果均不明顯，菌落擴(kuò)展直徑范圍(4.32±0.16) cm～(7.08±0.08) cm，抑制率1.78%～19.49%；處理3 min，對(duì)灰葡萄孢菌的抑制效果顯著，抑制率達(dá)到100.00%，達(dá)到殺菌效果，對(duì)另外3種草莓病原真菌抑制效果不顯著；處理5 min，對(duì)立枯絲核菌的抑制效果顯著，抑制率達(dá)到100.00%，達(dá)到殺菌效果，對(duì)另外2種草莓病原真菌抑制效果不顯著。

表1 等離子體處理對(duì)4種草莓病原真菌的抑制比較Tab.1 Comparison of inhibition rates of plasma treatment on 4 strawberry pathogenic fungi

2.2 等離子體處理對(duì)不同病原真菌的敏感性測(cè)定

等離子體處理對(duì)4個(gè)草莓病原真菌毒力回歸方程及LT50值計(jì)算統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。等離子體處理對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用時(shí)間最短，LT50為1.670 min；對(duì)立枯絲核菌抑制作用時(shí)間次之，LT50為2.673；對(duì)尖孢鐮刀菌和膠孢炭疽菌抑制作用時(shí)間較長(zhǎng)，LT50分別是4.204和4.668。

3 討 論

草莓市場(chǎng)種植效益高，需求日益增加，但目前存在的化肥農(nóng)藥過(guò)度使用、各種草莓病害頻繁發(fā)生等問(wèn)題影響著草莓的生產(chǎn)發(fā)展[16]。農(nóng)業(yè)預(yù)防是控制草莓病害的基本措施，可以減少病害的發(fā)生，提高草莓的產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益[17]。目前,草莓病害的主要防治手段仍然是化學(xué)防治，因其防治對(duì)象廣泛,可以快速有效進(jìn)行防治,但是使用不當(dāng)很容易引起人類(lèi)和動(dòng)物中毒,環(huán)境污染,產(chǎn)生藥害[18]。為了彌補(bǔ)化學(xué)農(nóng)業(yè)(化肥、農(nóng)藥)和生物農(nóng)業(yè)(有機(jī)農(nóng)業(yè))的不足，現(xiàn)代物理技術(shù)被越來(lái)越多的應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。等離子體技術(shù)作為一項(xiàng)新興的高能物理技術(shù)，可以調(diào)控作物生長(zhǎng)、保持和提高作物產(chǎn)量品質(zhì)等，且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，生態(tài)意義明顯，適用于設(shè)施農(nóng)業(yè)和作物的工廠化生產(chǎn)，具有良好應(yīng)用前景。

表2 等離子體處理對(duì)4種草莓病原真菌的室內(nèi)敏感性比較Tab.2 Comparison of sensitivity of plasma treatment to 4 strawberry pathogenic fungi

目前，關(guān)于等離子體處理對(duì)于植物病原真菌直接的生長(zhǎng)抑制作用研究鮮有報(bào)道。王卓等[19]研究發(fā)現(xiàn)，等離子體處理可降低藍(lán)莓果實(shí)表面真菌數(shù)量，具有殺菌效果。ZAHORANOVA等[20]發(fā)現(xiàn)，等離子體處理可將接種于小麥種子表面的致病性鐮刀菌全部殺滅。該研究發(fā)現(xiàn)等離子體處理對(duì)4種草莓病原真菌有很好的抑制效果，且隨著時(shí)間的適當(dāng)增加，抑制效果越來(lái)越好，處理7 min后抑制率都可達(dá)到100.00%；其中對(duì)灰葡萄孢菌的抑制效果最好，LT50為1.67 min，處理3 min抑制率達(dá)到100.00%。將等離子體技術(shù)應(yīng)用到草莓病害防治乃至其他作物病害防治都具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

目前，等離子體處理對(duì)植物病原真菌抑制作用的研究尚處在探索階段，有很多機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)對(duì)4種草莓病原真菌進(jìn)行處理，均能達(dá)到100.00%的抑制效果。該試驗(yàn)結(jié)果是在室內(nèi)測(cè)定的，其田間防效受多因素影響，是否與室內(nèi)結(jié)果一致，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，等離子體處理對(duì)植物病原真菌和植物生長(zhǎng)的影響是復(fù)雜的過(guò)程，處理其他植物病原真菌的效果和對(duì)植物的影響及其詳細(xì)的作用機(jī)理等問(wèn)題還有待于更加深入的研究。