桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液體外對豬圓環病毒2型抗病毒效果初探

溫海京，周雙海，吳 瓊，張 濤，周 波，張鑫玉，張永紅*，崔德鳳*

(1.北京農學院動物科學技術學院/獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2.河北農業大學動物科技學院，保定071000；3.中牧實業股份有限公司，北京100070)

豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是現今生豬養殖產業體系中重點防控的傳染病原體之一。PCV2感染后可誘發一系列疾病，如斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、增生性壞死性間質性肺炎、非化膿性心肌炎與壞死性心肌炎以及繁殖障礙等生殖系統疾病，這些疾病現被統稱豬圓環病毒相關疾病(porcine circovirus associated disease，PCVAD)，屬中國二類動物疫病[1]。豬罹患PCVAD后，多表現為生長發育不良、消瘦，皮膚黏膜等蒼白或黃疸，呼吸障礙，體表淋巴結腫大，多系統炎癥等。種豬與60日齡以內的低齡仔豬均為PCV2感染的高度易感對象與重點保護對象，尤其是20日齡以內的低齡仔豬，在感染PCV2后致死率幾乎可高達100%[2]。PCV2感染均會導致病豬產生嚴重的免疫抑制，現已對世界生豬養殖業造成不容小覷的經濟損失。

中藥是中國燦爛文化的瑰寶，自千年前中藥就已應用于強身健體、治療疾病，近年來，伴隨著近現代科學技術飛速的發展，單味中藥、復方藥及中藥單體等制劑在臨床上的應用越來越廣泛，臨床上已有多項研究表明，諸如黃芪、苦參、板藍根等中藥均具有一定程度的抗PCV2感染作用[3-5]。研究表明，中藥桂枝復方中的桂枝-生姜聯用具有抗病毒作用[6]；白芍可作為抗流感病毒、皰疹病毒的獸用中草藥[7]。大黃復方中的大黃、大青葉、黃芪等均為可抑制病毒生長的中草藥且已投入到畜禽養殖中[7]。鑒于此，該研究采用PCR技術對采集某豬場疑似PCV2感染的組織病料分離培養后鑒定，豬腎細胞(PK-15細胞)體外感染其病毒，選取桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液處理細胞，探討桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液對分離鑒定的PCV2抗病毒效果，目的為生豬養殖業臨床中對PCV2的防治提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

疑似斷奶仔豬多系統衰竭綜合征組織病料采集自某豬場并保存于北京農學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室；PK-15細胞由北京農學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室保存；桂枝、白芍、白術、附子、干姜、甘草、大黃、大青葉、蒲公英、青蒿、連翹、梔子、千里光、生石膏、黃苓、黃芪均購自北京同仁堂藥店永旺分店；DMEM、胰酶、青鏈霉素雙抗、胎牛血清均購自Gibco公司；PBS、TAE、GoldenView核酸染料、CCK8細胞活力檢測試劑盒、Marker購自北京索萊寶科技有限公司；病毒核酸提取試劑盒、2×Pro Taq預混液、熒光定量SYBR Green預混液購自湖南艾科瑞生物有限公司；引物及瓊脂糖凝膠粉購自北京擎科生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病料的處理及PCR擴增 取疑似斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的組織病料，充分剪碎后，加入1 mL生理鹽水于組織勻漿器內制成勻漿組織，轉移至離心管后，4 ℃ 下6 000 r/min離心10 min，收集上清液，根據病毒核酸提取試劑盒說明書提取樣品DNA，置于-20 ℃保存。

使用特異性引物(F為GCGGGCCAAAAAAGGTACAGTTCC；R為ACCAGCGCACTTCGGCAGCG GCAG)對PCV2的ORF2基因進行20 μL體系的PCR擴增反應，目的基因片段790 bp。PCR擴增體系為2×Pro Taq預混液10 μL，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，No-RNase水6 μL；反應條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環，72 ℃延伸7min。取5 μL擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件110 V、30 min。

1.2.2 PCV2的分離與培養 選取PCR結果為PCV2核酸陽性的病料，與含有雙抗的DMEM經研磨器制成組織勻漿后，反復凍融3次，離心獲得的上清液經0.22 μm濾器過濾除菌后，按照1∶10的比例接種于長勢良好的PK-15細胞，吸附1.5 h，加入含2%胎牛血清的培養液，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱內繼續培養48 h。連續盲傳6代，收獲F6代細胞培養物，反復凍融3次，1 500 r/min離心7 min，吸取上清液即為培養病毒液。

1.2.3 PCV2分離株ORF2基因序列遺傳進化分析 提取病毒培養物內50 μL的DNA進行PCR擴增反應：2×Pro Taq預混液25 μL，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板5 μL，No-RNase水16 μL；反應條件同“1.2.2”。取5 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產物交由北京擎科生物有限公司進行測序，利用MEGA-X 10.2.5軟件將該分離株(命名為BY株)與GenBank中PCV2分離株和其他可引起相似臨床呼吸道癥狀的病毒，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory disease virus，PRRSV)和豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)的ORF2基因、豬圓環病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)、豬圓環病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)、豬圓環病毒4型(porcine circovirus type 4，PCV4)、不同基因型的PCV2基因進行序列比對，繪制基因進化樹，分析其同源性。

1.2.4 病毒細胞半數感染量(TCID50)測定 將狀態良好的PK-15細胞接種于96孔板中培養24 h，待細胞長至單層后，棄去孔中的培養基，分別向每孔中加入200 μL經10倍梯度倍比稀釋的病毒液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7)，每個稀釋度設置8個重復，置于37 ℃5%CO2培養箱培養48 h，反復凍融3次，1 500 r/min 離心7 min，分別吸取上清，提取各孔病毒DNA，經PCR擴增與電泳，記錄各稀釋度下陽性孔數量，根據Reed-Muench公式計算出TCID50。

1.2.5 PCV2體外增殖規律測定 6孔板內接種100TCID50病毒液覆蓋至細胞表面，37 ℃5%CO2培養箱孵育1.5 h，孵育過程中每15 min晃動1次，1.5 h后加入2%維持培養基繼續置于培養箱中培養12、24、48和72 h后提取病毒DNA，將不同時間的病毒培養產物DNA樣品與10倍梯度稀釋的自建質粒標準品進行絕對定量PCR擴增，反應體系為10 μL 的2×SYBR GREEN MIX，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX(20 μmol/L) 0.4 μL，模板2 μL，6.8 μL的RNase free water；程序為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，66 ℃退火30 s，40個循環。分析不同培養時間內病毒載量，繪制病毒生長曲線。

1.2.6 桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液的制備 桂枝復方水煎液：按配比稱取桂枝、白芍、白術、附子、干姜、甘草共500 g，置于3倍體積超純水中浸泡2 h后，武火煎至沸騰后轉文火繼續煎煮30 min，過濾藥渣得到藥液，藥渣繼續添加3倍體積超純水，同樣方式煎煮30 min，合并2次提取藥液，旋轉蒸發水分，將藥液濃縮至500 mL，即得到1 g/mL桂枝復方水煎液。將藥液先后置于16層紗布脫脂棉、4層濾紙，1 000 r/min離心10 min，吸取藥液上清，先后使用0.45 μm與0.22 μm微孔濾膜除菌，最終得到生藥含量1 g/mL無菌桂枝復方水煎液，置于4 ℃暫存備用。

大黃復方水煎液：按配比稱取大黃、大青葉、蒲公英、青蒿、連翹、梔子、千里光、生石膏、黃苓、黃芪共500 g，大黃打粉并置于沸水中浸泡30 min，其余各中藥成分置于3倍體積超純水中浸泡2 h后，合并大黃浸出液與其他中藥，同桂枝復方水煎液的處理方法獲得生藥含量為1 g/mL無菌大黃復方水煎液。

1.2.7 桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液安全質量濃度測定 設置空白對照組、細胞對照組、桂枝復方水煎液組、大黃復方水煎液組。

空白對照組內只添加DMEM培養液。細胞對照組添加細胞及DMEM培養液。桂枝復方水煎液組：將100 mg/mL的桂枝復方水煎液用DMEM依次進行2倍倍比稀釋至100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.20 mg/mL。大黃復方水煎液組：將20 mg/mL的大黃復方水煎液用DMEM依次進行2倍倍比稀釋至20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、 0.08和0.04 mg/mL。

向96孔板內的PK-15細胞各加入200 μL的桂枝復方水煎液(質量濃度分別為100.00、 50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.20 mg/mL)或大黃復方水煎液(質量濃度分別為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08和0.04 mg/mL)，細胞對照組及空白對照組加入200 μL的DMEM。37 ℃5%CO2培養箱培養48 h后，棄去孔內的培養基，每孔加入100 μL的DMEM與10 μL的CCK-8試劑，繼續孵育1 h，讀取各孔OD450 nm值，根據公式計算各孔細胞活力，公式如下：

細胞存活率=(桂枝復方水煎液組OD450 nm值-空白對照組OD450 nm值)/(細胞對照組OD450 nm值-空白對照組OD450 nm值)×100%

細胞存活率=(大黃復方水煎液組OD450 nm值-空白對照組OD450 nm值)/(細胞對照組OD450 nm值-空白對照組OD450 nm值)×100%

1.2.8 桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液抗PCV2作用試驗 在細胞安全范圍內桂枝復方水煎液分為4組即對照組(0.00 mg/mL)、低劑量組(1.56 mg/mL)、中劑量組(3.13 mg/mL)和高劑量組(6.25 mg/mL)；大黃復方水煎液分為4組即對照組(0.00 mg/mL)、低劑量組(1.25 mg/mL)、中劑量組(2.50 mg/mL)和高劑量組(5.00 mg/mL)。

分別以3種不同方式處理PK-15細胞，進行抗PCV2作用試驗。

預防作用(先加藥后加毒)：低劑量組、中劑量組和高劑量組每孔加入1 mL桂枝復方水煎液或大黃復方水煎液，對照組加入1 mL的DMEM；置于37 ℃5%CO2培養箱中孵育1.5 h，棄液后每孔加入1 mL的100TCID50PCV2病毒液，繼續培養1.5 h后，棄去孔中培養基；將所有孔內的細胞培養物反復凍融3次，1 500 r/min離心10 min獲得上清液，提取病毒核酸，進行熒光定量PCR絕對定量法測定，比較各孔內的病毒載量，分析桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液體外對PCV2的預防作用。

殺滅作用(藥與毒同時作用)：低劑量組、中劑量組和高劑量組的桂枝復方水煎液或大黃復方水煎液與100TCID50PCV2病毒液1∶1混合，對照組使用DMEM與病毒液混合；置于37 ℃5%CO2培養箱中孵育1.5 h后接種1 mL于PK-15細胞中繼續培養1.5 h，棄去孔中培養基，所有孔內細胞培養物反復凍融、離心、核酸提取及熒光定量PCR擴增，得到各孔內病毒載量，分析桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液體外對PCV2的殺滅作用。

治療作用(先加毒后加藥)：每孔加入1 mL 100TCID50PCV2病毒液，置于37 ℃5%CO2培養箱中孵育1.5 h，棄液。低劑量組、中劑量組和高劑量組每孔加入1 mL桂枝復方水煎液或大黃復方水煎液，對照組加入1 mL的DMEM；繼續培養1.5 h后棄去孔中培養基，將各孔內細胞培養物反復凍融、離心、核酸提取和熒光定量PCR擴增，根據各孔內病毒載量比較桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液體外對PCV2的治療作用。

1.3 試驗結果統計分析

試驗數據均采用SPSS 25.0軟件進行統計處理，使用單因素方差分析組間數據的差異顯著性，P<0.05具有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCV2分離鑒定及培養

2.1.1 PCV2分離鑒定 采用PCR法對某豬場采集的組織樣品分離及檢測，結果見圖1。5份病料中有1份病料組織樣品中出現特異性擴增條帶，約790 bp，與陽性對照引物擴增條帶結果一致，由此判定該豬場有豬感染PCV2(圖1)。將陽性樣品PCV2分離株BY株接種于無PCV污染的PK-15細胞中連續盲傳6次，取F6代細胞培養物進行PCR檢測，結果F6代的擴增及電泳結果與PCV2陽性對照結果一致(圖2)。為深入了解陽性樣品PCV2分離株基因及株型情況，將PCV2分離株BY株F6代細胞培養物ORF2基因的PCR擴增產物進行測序，應用NCBI內的BLAST對測序結果進行基因序列比對分析，圖3是BY株序列系統進化情況。采用MEGA-X 10.2.5軟件對BY株ORF2基因與PCV2、PCV1、PCV3、PCV4、PRRSV、PPV的基因序列進行遺傳進化分析，圖3A顯示BY株ORF2基因序列與GenBank中已收錄的PCV2序列同源性達到99.47%～99.60%， BY株與PCV2有較近的親緣關系，BY分離株為PCV2毒株，與其他病毒遺傳關系較遠；再次將BY株基因組與GeneBank內PCV2的2a-2f不同分型的序列[8-9]進行比對分析，圖3B顯示BY株屬PCV2d型。

注：M是Marker；1是陰性對照；2是陽性對照；3-7是病料樣品。Note: M is Marker; 1 is negative control; 2 is positive control; 3-7 is samples of diseased materials.圖1 疑似PMWS病料檢測Fig.1 Detection of suspected PMWS materials

注：M是Marker；1是陽性對照；2是BY株F6代培養物。Note: M is Marker; 1 is positive control; 2 is F6 culture of BY.圖2 BY株F6代培養物PCR檢測Fig.2 PCR detection of F6 culture of BY

2.1.2 PCV2培養及生長特性分析 采用普通PCR法測定PCV2 F6代培養物的病毒滴度，計數每個病毒稀釋度下的PCV2陽性孔與陰性孔，根據Reed-Muench法計算出病毒的TCID50為10-4.3/0.1 mL(表1)。

注：A為BY株ORF2基因序列系統進化樹分析；B為BY株PCV2基因分型系統進化樹分析。Note:A is the phylogenetic tree analysis of ORF2 gene sequence of BY; B is the phylogenetic tree analysis of PCV2 genotyping of BY.圖3 BY株序列系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of F6 generation of BY

表1 PCV2的TCID50測定Tab.1 TCID50 determination of PCV2

采用建立的絕對定量的方法檢測100TCID50PCV2感染不同時間點細胞內病毒cap基因的表達量如圖4所示。cap基因的表達量隨時間逐漸增加，在48 h達到高峰后逐漸下降，因此，在后續試驗中采用48 h作為PCV2感染后的孵育時間點。

2.2 桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液體外對分離鑒定的PCV2抗病毒效果

2.2.1 對PK-15細胞活力的影響 將不同質量濃度的桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液分別作用于生長良好的PK-15細胞，根據酶標儀測定的OD450 nm值，計算細胞活力(圖5)。12.50 mg/mL的桂枝復方水煎液可對細胞造成一定的毒性損傷作用，且隨著質量濃度的升高，細胞活力逐漸降低；5.00 mg/mL及以下質量濃度的大黃復方水煎液對細胞的生長無損傷作用。

注：A為PCV2 cap基因絕對定量檢測方法標準曲線；B為PCV2的生長曲線。Note: A is the standard curve of PCV2 cap gene absolute quantitative detection method; B is the growth curve of PCV2.圖4 PCV2在PK-15細胞中的復制Fig.4 Replication of PCV2 in PK-15 cells

圖5 CCK8法篩選桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液對PK-15細胞的安全質量濃度Fig.5 CCK8 method for screening the safe concentration of CassiaTwig compound decoction and Rhubarb compound decoction on PK-15 cells

2.2.2 對PCV2的防治作用 絕對定量法可獲得每個樣品中的PCV2載量，6.25 mg/mL的桂枝復方水煎液體外對豬圓環病毒2型具有顯著的預防作用(P<0.05)(圖6A)及極顯著的治療作用(P<0.01)，3.13 mg/mL的桂枝復方水煎液可顯著降低細胞內豬圓環病毒2型的復制(P<0.05)(圖6C)，桂枝復方水煎液不具有體外直接殺滅豬圓環病毒2型的能力(圖6B)。5.00 mg/mL的大黃復方水煎液體外對豬圓環病毒2型具有顯著的預防作用(P<0.05)(圖6A)及極顯著的殺滅作用(P<0.01)，2.50 mg/mL的大黃復方水煎液可直接參與殺滅豬圓環病毒2型，顯著降低細胞內該病毒的載量(P<0.05)(圖6B)，大黃復方水煎液體外對豬圓環病毒2型感染后的治療作用不佳(圖6C)。

注：A為預防作用；B為殺滅作用；C為治療作用；桂枝復方水煎液與對照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；大黃復方水煎液與對照組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。Note: A is thepreventive effect; B is the killing effect; C is the therapeutic effect; compared with the control group and the CassiaTwig compound decoction, * means P<0.05, ** means P<0.01; compared with the control group and the Rhubarb compound decoction, # means P<0.05, ## means P<0.01.圖6 桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液體外對PCV2的防治作用Fig.6 The preventive effect of PCV2 of Cassia Twig compound decoction and Rhubarb compound decoction in vitro

3 討 論

近20年PCV2的感染一直處于多地區、高感染的態勢，且顯性、隱性感染均出現穩步上升趨勢，雖然疫苗的使用可在一定時間內顯著減輕感染豬的臨床癥狀，降低PCV2在豬群中的流行性和敗血癥的發生率，但隨著PCV2的不斷變異，新變異毒株的出現使得PCV2的流行情況有所提升[10]。目前PCV2可分為5個基因亞型，即2a、2b、2c、2d和2e[11]，2018年又增加了PCV2f型[12]，PCV2流行的毒株在2003年由PCV2a逐漸轉型為2b型，直到2012年PCV2d逐漸取代PCV2b成為近年來的流行毒株[13-14]。

該研究收集某豬場疑似PMWS病料，經PCR特異性擴增，鑒定為PCV2陽性，無菌處理后接種于無污染的PK-15細胞中，該病毒可在其中進行體外生長，盲傳6代后，經PCR與基因測序分析確定為PCV2且TCID50可達到10-4.3/0.1 mL。ORF2基因序列比對可知，分離的病毒BY株能夠與可引起相似呼吸道疾病的PPV、PRRSV及其他基因分型的豬圓環病毒區分開來，由此證明分離到的BY株確定為PCV2，同時PCV2毒株BY株與GeneBank內的不同基因亞型的序列進行比對，結果分離株為PCV2d型，與當前流行趨勢相符，其中新增PCV2f分型的加入，增加了分析數據的全面性。

現代藥理學研究表明，黃芪、黃芩、青蒿等位列獸醫常用十大抗病毒中藥[15]；具有清熱解毒功效的連翹、大青葉、蒲公英等可直接參與殺滅病毒，且在抑制病毒的復制、阻斷其吸附作用方面具有顯著功效[16]；甘草、白芍、白術等可調動全身的免疫防御系統，通過間接作用發揮其對宿主細胞的保護能力[17]。

該試驗選用的桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液包括多種抗病毒中草藥成分，大黃復方水煎液包含大黃、大青葉、蒲公英、青蒿、連翹、梔子、千里光、生石膏、黃苓、黃芪，桂枝復方水煎液包含桂枝、白芍、白術、附子、干姜、甘草。桂枝復方水煎液和大黃復方水煎液均具有一定的體外抗PCV2能力，抗病毒效果與使用劑量存在一定關聯，不同給藥順序呈現出不同的抗病毒作用，桂枝復方水煎液以PCV2感染后的治療作用為主，大黃復方水煎液以對PCV2殺滅作用為主，二者均可投入到進一步的臨床作用研究。