miR-122與急性缺血性腦卒中的相關性

王蒙蒙 王怡 林平 劉瓊瓊 曹平安 (大連大學附屬新華醫院，遼寧 大連 116000)

2016年全球總死亡人數的10.2%歸因于腦卒中，成為第二大死因〔1〕。 急性缺血性腦卒中具有發病率高、不易及時被發現且有效治療時間窗較短等特點。臨床病史和神經影像學是腦卒中診斷程序的基石。雖然神經影像學可以確診，但是敏感、快速且具有成本效益的血液檢查更有助于快速識別農村地區的腦卒中，從而有助于立即轉移患者進行溶栓治療〔2〕。目前關于急性缺血性腦卒中疾病缺乏高效的血清診斷標志物〔3〕。證據表明，外周蛋白、核酸或脂質可用于確認急性缺血性腦卒中的診斷并監測疾病進展〔4〕。蛋白質生物標志物已被更廣泛地研究，但靈敏度或特異性低。在血液中使用RNA作為診斷標記是一個新興領域，其臨床應用支持乳腺癌、冠狀動脈疾病和傳染病的診斷〔5〕。其中miRNA屬于一種內源基因，由18～25 個核苷酸組成的單鏈RNA 分子〔6〕，目前的研究報道發現miRNA與腦血管疾病的發生發展密切相關。miRNA可分布于細胞內和血清中，其中主要穩定存于血清的外泌體中〔7〕，有可能成為新型的基因診斷標志物。miR-122可減小缺血后的梗死面積，并影響著急性缺血性腦卒中的發生發展過程，與該疾病有著緊密的聯系〔8〕。因此本研究主要檢測血清外泌體中miR-122的表達水平，分析其作為急性缺血性腦卒中診斷標志物的可能性。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2019年1～12月大連大學附屬新華醫院神經內科急性缺血性腦卒中患者的血液標本60例(男28例，女32例)為腦卒中組，同時期體檢中心進行體檢的健康人群血液標本40例(男20例，女20例)為對照組。其中急性缺血性腦卒中的診斷均符合中華醫學會2014年的診療指南標準，所有受試者在癥狀出現后不到6 h入住神經內科，并通過CT或磁共振成像(MRI)掃描確診。排除標準：①既往有腦卒中史；②合并嚴重心、肝、腎疾病及腫瘤等；③患者未行動靜脈溶栓或機械取栓治療。患者的臨床基線特征，如年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥等比較，差異無統計學意義。見表1。本研究經大連大學附屬新華醫院倫理委員會確認，患者均知情同意且簽署書面知情同意書。

表1 兩組一般資料比較〔n(%)〕

1.2血液標本中miR-122表達的檢測 急性缺血性腦卒中患者的血液樣本在入院后24 h內抽取。并且所有健康對照樣品在禁食8～12 h后收集。血液標本在采集后的30 min 內首先用離心法收集血清，離心條件為2 200 r/min，10 min，4℃。并將血清維持在-80℃直至測量。根據總外泌體分離試劑(來自血清)試劑盒的說明書提取血清中的外泌體。再通過Trizol 提取法，裂解外泌體并提取血清中的總RNA，去除RNA 中的gDNA，按照反轉錄試劑盒說明書逆轉錄全部RNA 為cDNA。反應條件：42℃孵化15 min，85℃孵化5 s。最后通過SYBR 熒光法real-time PCR 技術，按照試劑盒說明書的反應體系，檢測miR-122 的表達，由公司設計合成引物序列，采用三步法的反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，55℃退火30 s，60℃延伸30 s，共40個循環；熔解曲線。線蟲(CEL)-39 作為內參對照，引物序列由公司設計并合成。最后使用2-ΔΔCt方法計算各組中miR-122的表達量。

1.3統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。通過受試者工作特征(ROC)曲線確定血清miR-122水平與急性缺血性腦卒中發生的相關性。

2 結 果

2.1兩組血清外泌體中miR-122的表達 相較于對照組，腦卒中患者發病后1 d組血清外泌體中miR-122的表達顯著升高(1.06±0.13 vs 2.20±0.31，P<0.05)；相對于對照組，急性缺血性腦卒中患者發病后7 d組血清外泌體中miR-122的表達顯著升高(2.38±0.31，P<0.05)。

2.2腦卒中患者血清miR-122表達的診斷性能 見圖1。

圖1 血清miR-122診斷發病1、7 d急性缺血性腦卒中的ROC曲線

發病后1 d，miR-122 ROC曲線下面積0.76(95%CI：0.66～0.86)，最佳臨界點為0.58，敏感性為70.00%，特異性為87.50%；發病后7 d，miR-122 ROC曲線下面積0.83(95%CI：0.75～0.91)，最佳臨界點為0.63，敏感性為75.00%，特異性為87.50%，血清miR-122在急性缺血性腦卒中具有較高的診斷價值。

3 討 論

目前在中國急性缺血性腦卒中是最常見的腦血管疾病類型〔9〕，然而迄今為止，仍然沒有血液生物標志物可預測和診斷急性缺血性腦卒中。今天的診斷主要基于臨床檢查、MRI或CT確認，這是耗時且昂貴的。因此，迫切需要開發血清(血漿)生物標志物，以準確預測和診斷缺血性腦卒中〔10〕。

報道證明特定的循環血清miRNA在來自患有不同疾病(包括缺血性腦卒中)的患者的血清(血漿)中是高度穩定并且可檢測的〔11〕。此外據報道，大概有超過20%的急性缺血性腦卒中存在miRNA的變化，因此研究者認識到miRNA與急性缺血性腦卒中的發生發展有著緊密的聯系。這些研究主要是在動物模型或體外進行，很少有研究調查循環血清外泌體中miRNA的表達與急性缺血性腦卒中患者發病的相關性〔12〕。急性缺血性腦卒中患者血清外泌體中miR-122的表達在發病前與發病后有著明顯的改變，而且miR-122包裹于外泌體，并分泌到體液中，可穩定的存在于血清中，所以miR-122是一種很有希望的急性缺血性腦卒中的潛在標志物〔13〕。

本研究目前還有一些局限性，樣本量相對較小，需要在大型研究中進一步驗證。其次，僅包括在發病后1 d和7 d收集的血液樣本，但未獲得有關動態改變其他時間點的信息。雖然循環血清miRNA作為生物標志物候選物在急性缺血性腦卒中疾病中很有價值，但并不足以廣泛應用于臨床實踐〔14〕，該方法仍未標準化。最后，由于本研究的重點是臨床相關性，沒有完全闡明生物學機制，需要進一步的功能研究，以深入了解其來源和生物學意義。