基于RIPK1/PGAM5通路探討二甲雙胍干預(yù)治療對高眼壓青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性變的影響

肖紅霞 楊海榮 曾云 葉漢元 (荊門市第二人民醫(yī)院眼科，湖北 荊門 448000)

青光眼是一組伴隨特征性視野缺損、視盤凹陷病理性擴(kuò)大的致盲性眼病，其發(fā)病率逐年增長〔1〕。罹患該病，伴隨周邊視力下降，不進(jìn)行干預(yù)治療會(huì)導(dǎo)致中心視力失明甚至永久性視力喪失〔2〕。青光眼危險(xiǎn)因素包括眼壓(IOP)升高、家族病史和高血壓，IOP升高會(huì)進(jìn)一步壓迫視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性變。已有研究證實(shí)，減緩視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性是治療青光眼重要方向〔3〕。RIPK1抑制劑(RIC)腹腔給藥對青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損害具有保護(hù)作用，且可防止視網(wǎng)膜色素上皮丟失〔4〕。RIPK1在程序性壞死中起著關(guān)鍵作用〔5〕。若能更好地了解眼內(nèi)壓介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性機(jī)制，可為青光眼患者挽救視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性變開辟道路〔6〕。因此，本項(xiàng)目基于前人經(jīng)驗(yàn)和課題，提出新的分子假說，揭示參與減緩視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性變的信號(hào)分子機(jī)制，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：北京醫(yī)療器械檢驗(yàn)所(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)清潔級(jí)大鼠72只，構(gòu)建高IOP青光眼手術(shù)模型；動(dòng)物使用和處理符合中華人民共和國國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)法和使用指導(dǎo)要求，且通過醫(yī)學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠體重0.32～0.42 kg，平均(0.34±0.03)kg；3～5月齡，平均(4.32±0.21)月齡；單籠飼養(yǎng)7 d；常規(guī)全面眼部檢查排除眼部其他疾患。

1.2造模及分組方法 建模：檢查眼膜上皮、眼底情況，采用美國TONO-PEN AVIA接觸式IOP筆(上海涵飛醫(yī)療器械有限公司)每天測量1次IOP，共測量3 d，取平均值作為大鼠基礎(chǔ)IOP。通過腹腔注射10 mg/kg二甲苯嗪(北京御生堂集團(tuán)，國藥準(zhǔn)字Z13022371)和 25 mg/kg氯胺酮鹽酸鹽麻醉大鼠，眼睛使用0.5%鹽酸丙環(huán)卡因進(jìn)行局部麻醉；制備大鼠右眼慢性高IOP：前房內(nèi)注入預(yù)先混合物，即原位交聯(lián)水凝膠(硫醇改性羧甲基透明質(zhì)酸：硫醇反應(yīng)性聚乙二醇二丙烯酸酯=4∶1)，從角膜向中央進(jìn)行前房穿刺，31號(hào)針通過切口將體積為7 μl的新鮮液體混合物立即注入前房，左眼不作為對照眼以減少動(dòng)物的痛苦；術(shù)后滴加0.5%鹽酸左氧氟沙星預(yù)防感染。假手術(shù)組誘導(dǎo)高IOP與建模組相似，但使用等量生理鹽水替代混合物。過程中死亡大鼠用無差異的存活大鼠補(bǔ)充。

建模成功30 min后將大鼠隨機(jī)分為9組，每組8只。A組(假手術(shù)組)，B組(模型組)，C組〔建模+腹腔注射含1 μg正常免疫球蛋白(IgG)的磷酸鹽緩沖液(PBS)2 μl〕，D組(建模+眼局部噴灑含1 μg二甲雙胍的PBS 2 μl)，E組(建模+腹腔注射含1 μg二甲雙胍的PBS 2 μl)，AMPK拮抗組(腹腔注射AMPK拮抗劑)，siRNA組(腹腔注射siRNA)，RIC組(腹腔注射RIC)，RIPK1激動(dòng)組(腹腔注射RIPK1激動(dòng)劑)。

藥物處理后采用術(shù)前所用IOP筆測量IOP 3次且取平均值，并于1 w后以80 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉深度麻醉大鼠，斷頭處死并取挫傷灶行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色和組織化學(xué)染色。

1.3視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)記和計(jì)量 在處死大鼠前7 d，注射細(xì)胞膜紅色熒光探針(Dil)進(jìn)入雙側(cè)上丘，將40 mg Dil混合到1 ml的二甲基亞砜(DMSO)中，立體定位坐標(biāo)是(6.4 mm,1.5 mm,4.0 mm)；注射1.5 μl Dil；7 d后，經(jīng)心灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，分離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層并完全固定于載玻片上，顯微鏡觀察拍照，采用Image J分析。

1.4視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞離體原代培養(yǎng) 分離視網(wǎng)膜，在37℃的杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBS)(無Ca2+，含20 U/ml木瓜蛋白酶、1 ml半胱氨酸、0.005% Mg2+)中孵育30 min；用無菌眼科剪在D-PBS緩沖液中輕輕剪碎視網(wǎng)膜，用牛血清白蛋白(BSA)溶液(含0.15%胰蛋白酶抑制劑、0.15%牛血清)和0.005%DNA酶使細(xì)胞再懸浮于含0.1%BSA的D-PBS緩沖液中；使用Thy1細(xì)胞表面抗原單克隆抗體(Thy-1mAb)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)；接種于多聚賴氨酸包被的預(yù)先置入蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

1.5判定標(biāo)準(zhǔn) 染色標(biāo)準(zhǔn)：①切片完整，厚度4～6 μm，厚薄均勻，無皺褶無刀痕；②染色核漿分明，紅藍(lán)適度，透明潔凈，封裱美觀。由兩位5年以上從事蘇木素-伊紅(HE)染色實(shí)驗(yàn)的臨床專業(yè)醫(yī)師在對臨床病理資料不知情情況下進(jìn)行判斷細(xì)胞陽性表達(dá)情況。染色判定標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)陽性細(xì)胞染色程度和所占比例進(jìn)行評分：無色：0分，淺色：1分，正常：2分，深色：3分；陰性(-)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰無顯色；弱陽性(+)：染色1分；陽性()：染色2分；強(qiáng)陽性()：3分。

1.6觀察指標(biāo)視網(wǎng)膜 ①IOP檢測：在全身淺麻醉下，吸入2%～4%異氟烷維持麻醉來測量IOP，以盡量減少由大鼠運(yùn)動(dòng)和應(yīng)激引起的誤差；用TonoLabReboundTonometer(芬蘭，萬塔伊卡爾)測量IOP。為避免晝夜節(jié)律的影響，在上午 10點(diǎn)至下午 2點(diǎn)連續(xù)6次測量后取平均值。②視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)檢測：進(jìn)行視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記和計(jì)量后，采用HE染色觀察視網(wǎng)膜切片神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)、內(nèi)叢狀層(IPL)、外核層(ONL)和外叢狀層(OPL)細(xì)胞密度變化及IPL厚度變化。③視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況：使用TUNEL法檢測。④線粒體功能檢測：肌肉注射麻醉大鼠后，在眼球后方3 mm處暴露視神經(jīng)并放入浸泡四甲基玫瑰胺氯化物染料的凝膠泡沫(美國Invitrogen公司)；縫合切口，局部應(yīng)用氧氟沙星眼藥膏；切片后使用熒光顯微鏡觀察視網(wǎng)膜3個(gè)部位，捕獲的橫切面上視神經(jīng)層的染料標(biāo)記線粒體，采用CCK-8比色法檢測并取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)熒光強(qiáng)度來判斷線粒體受損程度，熒光越弱受損越嚴(yán)重；記錄線粒體Cytc/a值、磷氧比(P/O)、H2O2變化。⑤在藥物處理結(jié)束后，獲取培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞新鮮細(xì)胞，使用Western印跡法檢測AMPK激活水平，RIPK1、Caspase-3、PGAM5、Keap1表達(dá)水平。取各組大鼠眼部組織，充分裂解，13 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(深圳子科生物科技有限公司)對蛋白定量；提取其中總蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入上樣緩沖液后沸水浴10 min使蛋白充分變性，此后依次經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉、兔抗人單克隆抗體(包括AMPK、RIPK1、Caspase-3、PGAM5、Keap1單克隆抗體)孵育、二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG孵育，采用超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒進(jìn)行蛋白檢測，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。⑥藥物處理結(jié)束后，獲取培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞新鮮細(xì)胞，采用RT-PCR技術(shù)檢測RIPK1、PGAM5的mRNA水平變化。采用Trizol試劑盒提取總RNA，并分析RNA完整性及純度；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RIPK1、PGAM5得cDNA，將其凍存于-20℃冰箱備用；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀與熒光定量PCR試劑盒依次對cDNA進(jìn)行預(yù)變性、變性、退火復(fù)性、延伸，并重復(fù)PCR操作次數(shù)增加擴(kuò)增產(chǎn)物；采用閾值比較法對結(jié)果進(jìn)行判定。引物序列：RIPK1正義鏈:5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，反義鏈:5′-ACCTTCACCGTTCCAGTT-3′；PGAM5正義鏈:5′-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3′，反義鏈:5′-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3。⑦使用免疫共沉淀技術(shù)檢測RIPK1和FDAA結(jié)合情況，Keap1和PGAM5結(jié)合情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney法。

2 結(jié) 果

2.1各組IOP比較 治療前，B、C、D、E、AMPK拮抗、siRNA、RIC、RIPK1激動(dòng)組IOP均顯著高于A組(P<0.05)；治療后，D、E、siRNA、RIC組IOP顯著低于治療前(P<0.05)，且顯著低于B、C、AMPK拮抗、RIPK1激動(dòng)組(P<0.05)；治療后siRNA、RIC組IOP顯著低于D、E組(P<0.05)。見表1。

表1 各組IOP比較

2.2各組GCL、IPL、ONL、OPL細(xì)胞密度變化及IPL厚度變化 B組GCL、IPL、ONL、OPL細(xì)胞密度、IPL細(xì)胞厚度顯著低于A組；D、E、siRNA、RIC組GCL、IPL、ONL、OPL細(xì)胞密度、IPL細(xì)胞厚度顯著高于B、C、AMPK拮抗、RIPK1激動(dòng)組(P<0.05)。見表2。

表2 各組GCL、IPL、ONL、OPL細(xì)胞密度變化及IPL厚度變化比較

2.3各組線粒體受損情況比較 B組線粒體Cytc/a、P/O、H2O2水平顯著低于A組(P<0.05)；D、E、siRNA、RIC組Cytc/a、P/O、H2O2水平均顯著高于B組(P<0.05)，AMPK拮抗、RIPK1激動(dòng)組Cytc/a、P/O、H2O2水平均顯著低于B組(P<0.05)；siRNA、RIC組Cytc/a、P/O、H2O2水平顯著高于C、D、E組(P<0.05)；見表3、圖1。

表3 各組線粒體受損情況及RIPK1、PGAM5 mRNA水平比較

2.4各組RIPK1、PGAM5 mRNA水平變化 B組RIPK1、PGAM5 mRNA表達(dá)水平均顯著高于A組；D、E、siRNA、RIC組RIPK1、PGAM5的mRNA表達(dá)水平低于B、C、AMPK拮抗、RIPK1激動(dòng)組(P<0.05)；見表3、圖2。

2.5各組AMPK、RIPK1、Caspase-3、PGAM5、Keap1表達(dá)水平 B組神經(jīng)組織中AMPK、PGAM5、Keap1表達(dá)水平顯著低于A組(P<0.05)，RIPK1、Caspase-3表達(dá)水平顯著高于A組(P<0.05)；siRNA、RIC組AMPK、PGAM5、Keap1表達(dá)水平顯著高于D、E組，D、E組高于B、C、AMPK拮抗、RIPK1激動(dòng)組(P<0.05)，siRNA、RIC組RIPK1、Caspase-3表達(dá)水平低于D、E組，D、E組低于B、C、AMPK拮抗、RIPK1激動(dòng)組(P<0.05)；見表4、圖3。

圖2 各組RIPK1、PGAM5 mRNA水平

表4 對比各組AMPK、RIPK1、Caspase-3、PGAM5、Keap1表達(dá)水平

圖3 各組AMPK、RIPK1、Caspase-3、PGAM5、Keap1表達(dá)水平

3 討 論

青光眼的病理學(xué)基礎(chǔ)及確定高IOP危險(xiǎn)因素均可為青光眼治療提供有價(jià)值的信息〔7〕。近年來隨著分子假說的廣泛應(yīng)用，有學(xué)者認(rèn)為對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分子機(jī)制全面細(xì)致研究能為青光眼治療提供更優(yōu)方案〔8〕。有研究認(rèn)為RIPK1作為受體相互作用蛋白(RIP)絲氨酸蘇氨酸激酶家族一員，可對TNFR1多種下游信號(hào)通路進(jìn)行控制，保證其穩(wěn)態(tài)〔9〕。另有文獻(xiàn)認(rèn)為，常規(guī)降糖藥二甲雙胍在AMPK通路中可促進(jìn)Keap1轉(zhuǎn)移到線粒體與PGAM5形成復(fù)合物，促進(jìn)PGAM5泛素化而降解，從而緩解心臟缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷〔10〕。

目前認(rèn)為參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的退行性變主要包括：一是在TNF-RSC中，RIPK1通過招募TAB1/2來促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子-β-活化激酶(TAK)1的激活，參與調(diào)節(jié)NF-κB激活；二是RIPK1通路中較多的Caspase-3可參與許多類型神經(jīng)退行性變，早有研究發(fā)現(xiàn)敲除 Caspase-3后可減慢乙醇誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡變性〔11〕；三是AMPK的激活可抑制RIP3介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和凋亡，可延緩神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的退行性變〔12〕。但目前RIPK1是否介導(dǎo)下游Caspase-3參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性變及RIPK1上游是否具有新的有效靶點(diǎn)來抑制RIPK1介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷仍需進(jìn)一步研究。本課題組根據(jù)前期研究和前沿科學(xué)研究成果，將二甲雙胍應(yīng)用于高眼壓青光眼實(shí)驗(yàn)研究，因其為糖尿病治療中常用藥物，且目前未見相關(guān)報(bào)道，具有一定創(chuàng)新性。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍治療后大鼠IOP、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失情況及線粒體損傷情況較治療前有顯著改善，提示二甲雙胍臨床治療有效。線粒體為細(xì)胞能量工廠，在細(xì)胞內(nèi)將糖等化合物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞能夠使用的能量，當(dāng)?shù)脱鯐r(shí)線粒體會(huì)產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致線粒體功能障礙。在王霞等〔13〕研究指出，線粒體功能的正常維持可保證細(xì)胞的正常功能。本研究另檢測RIPK1、PGAM5表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，治療組RIPK1呈低表達(dá)，PGAM5呈高表達(dá)，提示AMPK激活為二甲雙胍治療高IOP型青光眼有效靶點(diǎn)。另外，脂肪通過線粒體Ca2+超載誘導(dǎo)線粒體快速出現(xiàn)功能障礙，隨后通過 RIPK1 和 ERK1/2 激活產(chǎn)生過氧化物介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的死亡，但AMPK激活可逆轉(zhuǎn)RIPK1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Dang等〔14〕研究表明，主要生物活性成分木脂素在體外保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)損傷，還可對大鼠青光眼相關(guān)視神經(jīng)病變發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且這一保護(hù)作用是通過激活A(yù)MPK信號(hào)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用實(shí)現(xiàn)的。錢道衛(wèi)等〔15〕的離體研究實(shí)驗(yàn)比較了RIPK1三種不同抑制劑對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用，RIC可保護(hù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受缺氧缺糖損傷，而Nec-1、Cpd27可挽救TNF-α所致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡。有研究認(rèn)為AMPK是RIPK1/PGAM5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，AMPK磷酸化后可調(diào)節(jié)的底物蛋白進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞一系列生理過程〔16〕。王超〔17〕研究發(fā)現(xiàn)敲減AMPK后神經(jīng)細(xì)胞中PGAM5、Keap1 蛋白減少，這與本研究結(jié)果相符，提示AMPK可通過抑制RIPK1活性減緩細(xì)胞退行性變。為了驗(yàn)證RIPK1與PGAM5是否具有相關(guān)性，本研究進(jìn)行了mRNA定量分析，結(jié)果提示PGAM5對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移有負(fù)調(diào)控作用。

綜上，二甲雙胍激活A(yù)MPK通過抑制RIPK1介導(dǎo)青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的退行性變；被RIPK1激活的PGAM5介導(dǎo)線粒體功能障礙促青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的程序性壞死，二甲雙胍激活A(yù)MPK促進(jìn)Keap-1與線粒PGAM5形成復(fù)合物進(jìn)而促使PGAM5降解，改善線粒體功能，從而發(fā)揮抑制神經(jīng)節(jié)細(xì)胞程序性壞死的作用。