不同生物炭對豬糞堆肥過程中抗生素及抗生素抗性基因的削減規律研究*

包燦鑫 張 園 陳明龍 周 潔 何文程 史鑫成

(蘇州科技大學環境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009)

抗生素被廣泛應用于畜禽養殖業，未被完全吸收的抗生素和在動物腸道內攜帶抗生素抗性基因(ARGs)的菌株隨著畜禽糞便排出體外[1]，動物養殖業造成的畜禽糞便污染成為環境中抗生素和ARGs的主要污染源之一。現有研究表明，好氧堆肥能有效降低豬糞中的抗生素濃度和ARGs豐度[2-3]，進而減輕畜禽糞便還田對環境中抗生素和ARGs的影響。生物炭是生物質在低溫、缺氧條件下熱解形成的一種多孔富碳產物，由于多孔、疏水性和低密度的特性常被用于農業領域來解決能源、環境、食品和氣候等多方面的問題。

對于抗生素，SRINIVASAN等[4]研究發現，高溫制備的松木屑生物炭比低溫生物炭能更顯著增加牧場土壤對磺胺甲惡唑(SMX)的吸附；韓璇[5]研究發現，水稻秸稈生物炭對底泥中SMX的吸附機制主要為沉淀作用和表面絡合作用，吸附能力明顯強于再力花生物炭；陳淼等[6]研究發現，甘蔗渣生物炭提高了土壤對氧氟沙星和諾氟沙星(NOR)的吸附量，非線性吸附過程主要受到表面吸附、分配作用和其他微弱作用力的共同影響。還有研究發現，生物炭的比表面積和芳香化結構影響著抗生素的分配系數[7]；PENG等[8]通過實驗，發現了不同生物炭對抗生素的吸附源于抗生素上的π鍵與生物炭芳香環上的π鍵形成π-π電子供體-受體作用(π-π EDA)。對于ARGs，生物炭作為一種理想的填充劑，可調節水分含量，為堆肥混合物中的微生物提供最佳的氣體環境和適宜的棲息地，可有效地提高堆肥處理中ARGs的去除效果。以水稻秸稈為原料制備的生物炭對ARGs的豐度沒有明顯的影響[9]；而CUI等[10]研究表明，蘑菇渣制備的生物炭可有效降低豬糞堆肥過程和產物中的ARGs；LI等[11]在雞糞堆肥中添加不同比例竹炭，可使堆肥產物中ARGs減少21.6%～99.5%；錢勛[12]研究表明，添加生物炭可使堆肥產物中ARGs總豐度比對照低81%，生物炭降低了ARGs宿主菌的豐度從而導致ARGs降低。

然而，目前研究生物炭對土壤、底泥中抗生素的降解較多，將生物炭應用于豬糞好氧堆肥，分析其對豬糞中抗生素和ARGs削減的研究較少，關于不同生物炭對豬糞堆肥過程中抗生素及ARGs的削減規律仍需進一步探討。本研究通過制備玉米秸稈生物炭(草本類生物炭)、竹炭(木本類生物炭)和豬糞生物炭(動物生物質類生物炭)，重點探討添加3種不同類型生物炭對豬糞好氧堆肥過程中抗生素濃度及ARGs豐度的影響。該研究結果為不同情況下選擇合適的生物炭提供理論指導，可以幫助管理糞便來源中由抗生素抗性引起的生態風險。

1 材料和方法

1.1 堆肥原料

新鮮豬糞取自蘇州某養豬場，玉米秸稈粉末取自蘇州某農田，竹子取自蘇州某竹林，表1列出了堆肥原料的理化性質。堆肥添加的玉米秸稈生物炭、竹炭和豬糞生物炭的制備條件為600 ℃熱解30 min，3種生物炭的元素組成和孔隙特征見表2、表3和圖1。

圖1 玉米秸稈生物炭、竹炭和豬糞生物炭的掃描電鏡圖

表1 材料的理化性質1)

表2 玉米秸稈生物炭、竹炭和豬糞生物炭的元素組成

表3 玉米秸稈生物炭、竹炭和豬糞生物炭的孔隙特征

1.2 試驗設計

3種類型的生物炭添加量均為0.12 kg(堆體總質量的10%)，填裝在堆肥罐內(聚氯乙烯材質，體積為5 L)。將反應器置于恒溫水浴鍋內，根據堆體內部的溫度對恒溫水浴鍋進行階段升溫，以期模擬實際堆肥的自升溫過程[13]。根據生物炭類型不同共設置3個處理組(CP為玉米秸稈生物炭-豬糞堆肥處理組，BP為竹炭-豬糞堆肥處理組，PP為豬糞生物炭-豬糞堆肥處理組)和1個空白對照組(CK為不添加生物炭堆肥處理組)，每個處理組均設置5個平行。堆肥反應持續60 d，每3天翻堆1次，每天17：00測量堆體溫度和環境溫度。根據堆體溫度變化分別在堆肥1、7、15、45、60 d時采集樣品，置于-20 ℃保存待測。

1.3 樣品分析

1.3.1 理化性質測定

樣品的C、H、O、N、S含量采用元素分析儀(Vario MAX)測定；pH用pH計(PHS-3E)測定，土水比為1 g∶5 mL；通過場發射掃描電子顯微鏡(S-4800)得到不同生物炭的形貌，利用比表面積及孔徑分析儀(V-Sorb 2800P)和BET計算方法得到不同生物炭的比表面積、總孔體積和平均孔徑。

1.3.2 抗生素的測定

樣品的前處理采用固相萃取法(SPE)，處理過程主要參考文獻[13]。本研究測定了堆肥中9種抗生素濃度，分別是3種四環素類抗生素(TCs)——四環素(TC)、土霉素(OTC)和強力霉素(DOX)，3種磺胺類抗生素(SAs)——磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)和SMX，3種喹諾酮類抗生素(QNs)——恩諾沙星(ENR)、環丙沙星(CIP)和NOR，采用高效液相色譜儀(Ultimate 3000)—三重四極桿質譜儀(TSQ Quantum Ultra EMR)測定抗生素濃度[14]。

1.3.3 DNA提取和ARGs的定量

采用DNA提取試劑盒(FastDNA?SPIN Kit)提取堆肥樣品微生物基因組DNA[15]。本研究定量分析了4種四環素類抗性基因(TRGs，包括tetA、tetC、tetG和tetX)、3種磺胺類抗性基因(SRGs，包括sul1、sul2和sul3)和1種喹諾酮類抗性基因(QRGs，qnrS)，這些ARGs的引物設計主要來源于文獻[16]至文獻[19]。

在實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀(ABI 7500)上進行定量PCR反應，設置20 μL的反應體系：包括SYBR Premix Ex Taq酶溶液10 μL、前后引物(10 μmol/L)0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ溶液0.4 μL、模板DNA(10 ng/μL)2 μL、雙蒸餾水 6 μL。

反應結束后根據CT值(從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數)來確定起始模板濃度，以拷貝數為橫坐標，CT值為縱坐標繪制標準曲線。隨后使用建立好的實時熒光定量PCR方法，對未知樣品進行定量PCR，檢測樣品中ARGs拷貝數從而計算豐度，每個樣品做3個技術重復。

2 結果與分析

2.1 添加不同生物炭對堆肥過程中抗生素濃度的影響

各處理組的抗生素總濃度均隨著堆肥的進行不斷降低，TCs、SAs和QNs的總濃度基本符合升溫階段(1 d)>高溫階段(7、15 d)>冷卻階段(45 d)>腐熟階段(60 d)的變化規律(見圖2)。其中，BP中抗生素的總質量濃度從312.45 μg/kg降到了8.90 μg/kg，降低了97%，效果最好；PP中抗生素的總質量濃度從311.84 μg/kg降到了28.60 μg/kg，降低了90%；CP中抗生素的總質量濃度從305.80 μg/kg降到了48.29 μg/kg，降低了84%。BP中TCs從195.72 μg/kg降到了3.70 μg/kg，SAs從58.71 μg/kg降到了3.70 μg/kg，QNs從58.02 μg/kg降到了1.50 μg/kg，TCs、SAs和QNs的去除率相比其他處理組均最高，分別為98%、94%和97%。PP中TCs從195.08 μg/kg降到了11.08 μg/kg，去除率達到94%，SAs從57.94 μg/kg降到了11.32 μg/kg，去除率僅有80%；而CP中3類抗生素的去除率均是各處理組中最低的，特別是SAs，去除率僅有74%。

注：字母不同代表樣品之間有顯著性差異(P<0.05)，圖3同。

2.2 添加不同生物炭對堆肥過程中ARGs豐度的影響

各處理組的ARGs總豐度均隨著堆肥的進行先上升后下降，TRGs、SRGs和QRGs的總豐度符合高溫階段(7、15 d)>冷卻階段(45 d)>升溫階段(1 d)>腐熟階段(60 d)的變化規律(見圖3)。其中，竹炭的添加使BP中ARGs的總豐度從1011.27拷貝數/g降到了1010.99拷貝數/g，降低了48%；qnrS的豐度降幅最大，從107.38拷貝數/g降到了105.90拷貝數/g，下降了97%；而sul3的豐度下降的最少，從109.53拷貝數/g降到了109.52拷貝數/g，僅下降了1%。豬糞生物炭的添加使PP中ARGs的總豐度從1011.26拷貝數/g降到了1011.07拷貝數/g，降低了36%；tetA的豐度降幅最大，從1010.65拷貝數/g降到了109.84拷貝數/g，下降了85%；而sul3的豐度降幅最小，從109.53拷貝數/g降到了109.52拷貝數/g，僅下降了2%。玉米秸稈生物炭的添加使CP中ARGs的總豐度從1011.26拷貝數/g降到了1011.15拷貝數/g，降低了23%；tetC的豐度降幅最大，從109.61拷貝數/g降到了108.84拷貝數/g，下降了83%；而tetG的豐度降幅最小，從1010.48拷貝數/g降到了1010.26拷貝數/g，僅下降了40%。

圖3 堆肥過程中8種ARGs的豐度變化

然而，sul2在各處理組中的豐度均有上升并成為豐度最高的ARGs，竹炭的添加使得BP中sul2的豐度從1010.62拷貝數/g上升到1010.75拷貝數/g，升高了26%；玉米秸稈生物炭的添加使得CP中sul2的豐度從1010.57拷貝數/g上升到1010.94拷貝數/g，升高了57%；豬糞生物炭的添加使得PP中sul2的豐度從1010.55拷貝數/g上升到1010.78拷貝數/g，升高了41%。

3 討 論

3.1 添加不同生物炭對豬糞堆肥過程中抗生素濃度的影響分析

還原性、穩定性、極性和芳香性的差異可能是3種生物炭吸附效率不同的主要原因，同時，在生物炭吸附抗生素過程中，通常不是單一機制，而是多種吸附機制的結合。吸附過程可分為外表面吸附和內表面吸附，主要由生物炭和抗生素芳香環組成的π-π EDA吸附抗生素[20]。

添加竹炭堆肥對抗生素的平均去除率最高。π-π EDA是竹炭吸附抗生素的一個重要機制，元素分析表明，竹炭的H/C最小，擁有更高的芳香環結構和更高的芳構化程度[21]。竹炭表面的羧基、硝基和酮基可充當電子受體，與抗生素形成π-π EDA從而增強了吸附效果，并且生物炭中不同類型的羥基和氨基也可作為π電子供體。孔隙填充也可看成是竹炭吸附抗生素的一個重要機制。抗生素在竹炭上的吸附可通過擴散到生物炭表面孔隙或未碳化餾分的有機物基質上而實現。竹炭具有較大的比表面積和較多的孔隙結構，可以提供較理想的物理吸附位點，使其表面能接觸到較多的抗生素；同時增強了抗生素的內擴散，提高了吸附效率。另外，迅速上升的溫度可以影響微生物群落，改變堆料性質，使抗生素降解。

添加玉米秸稈生物炭堆肥對抗生素的平均去除率最低，因為玉米秸稈生物炭具有較高的灰分和特殊的官能團結構，較大的孔徑結構與TC、SD和ENR等抗生素不契合，這些抗生素被吸附后很快從炭孔中解吸[22]，造成玉米秸稈生物炭與抗生素之間的填充未充分發揮作用。其中π-π EDA、金屬橋介導、表面絡合作用是玉米秸稈生物炭吸附抗生素的主要機制，并可能存在陽離子交換。

添加豬糞生物炭堆肥對抗生素的去除具有選擇性。疏水作用是生物炭吸附抗生素的另一個機制。通常，低表面氧化的生物炭具有疏水性，可通過疏水作用與疏水性有機化合物發生反應，從而達到削減抗生素的目的。豬糞生物炭具有較高的氧含量，在含氧官能團周圍形成大量水分子簇導致其疏水性強[23]，而水分子簇與抗生素的競爭削弱了生物炭對部分抗生素的吸附能力。

3.2 添加不同生物炭對豬糞堆肥過程中ARGs豐度的影響分析

為了減少畜禽養殖中ARGs向環境中傳播，好氧堆肥是一種削減糞便中ARGs豐度的重要技術。本研究中竹炭的添加使得BP中ARGs的總豐度降低了48%，效果最好；其中，qnrS的豐度降幅最大(97%)。竹炭能較好地降低qnrS的豐度是因為它能夠大幅降低QRGs的運輸[24]。但竹炭對ARGs的削減也具有選擇性，例如竹炭不能很好地降低sul3的豐度，因為它擁有多孔結構，增大了微生物之間的空隙，可能會降低不同微生物之間的聯系。因此，生物炭可能會通過降低基因水平轉移作用從而減少部分ARGs在不同微生物之間的傳播。豬糞生物炭的添加使ARGs的總豐度降低了36%，效果次之；其中，tetA的豐度降幅最大(85%)，而sul3的豐度僅下降了2%。玉米秸稈生物炭的添加使CP中ARGs的總豐度降低了23%，效果不佳；其中，tetC的豐度降幅最大(83%)。以上ARGs的削減可能源于生物炭的吸附解吸作用，該作用導致部分功能微生物出現衰亡，細胞裂解釋放的DNA與胞外DNA同時被水解或生物降解；堆肥期間特定的溫度、濕度和pH條件下，微生物體內功能性核酸酶的催化降解作用觸發ARGs消解，DNA分子逐漸脫穩，部分雙鏈分子結構逐漸轉變為單鏈分子結構，同時，磷酸二酯鍵斷裂，氫鍵穩定性降低，末端堿基脫落，均促進ARGs得到有效消解。

然而，sul2在各處理組中的豐度均有上升并成為豐度最高的ARGs，ZHANG等[25]和SELVAM等[26]認為sul2豐度的增加與微生物群落結構的差異有關，這可能是由于生物炭攜帶了上述基因或為其宿主菌提供了良好的繁殖環境，因此豐度升高。本研究中添加玉米秸稈生物炭堆肥中sul2的豐度增幅最大(57%)，這與WANG等[27]的研究一致，玉米秸稈生物炭能增加動物糞便高溫堆肥中sul2的豐度。添加竹炭堆肥中sul2的豐度增幅最小(26%)，溫度可能是影響sul2變化的重要因素[28]，以此推斷本研究中添加竹炭的堆體溫度適宜，在一定程度上抑制了sul2豐度的升高。

4 結 語

本研究對比添加不同生物質來源的生物炭對堆肥過程中抗生素及ARGs的影響，發現添加竹炭堆肥對豬糞中抗生素及ARGs的降解效果最佳，實現了木本類生物炭的高附加值利用，同時也實現了畜禽糞便的資源化利用，降低了畜禽糞便中殘留的抗生素及ARGs帶來的生態風險。

本研究為不同情況下選擇合適的生物炭提供理論指導，但生物炭對堆體中抗生素及其ARGs削減機制還需進一步研究，堆體中微生物群落的變化與抗生素、ARGs削減規律的聯系，抗生素降解菌與ARGs潛在宿主微生物的貢獻需要重點關注。