葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統處理養殖廢水的影響研究*

韋嘉璐 艾思潔 張 芯 王 磊 吳國芳 王海英#

(1.中南民族大學生命科學學院，湖北 武漢 430074；2.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016)

微藻是一類光合自養生物，具有生長周期短、環境適應性強的特性[1]，可以去除養殖廢水中的氮、磷及金屬離子等[2]，但純藻系統在處理養殖廢水時存在明顯缺陷，如穩定性差、易被外來物種污染、對設備要求高、對污水中COD去除效果不佳等[3]。近年來，建立藻菌共生系統進行廢水處理的研究引起了廣泛關注。DE BASHAN等[4]采用巴西固氮螺菌與小球藻組成藻菌共生系統，其對城市污水中的氨氮、硝酸鹽氮和磷的去除效率分別達到100%、15%和36%，顯著高于純藻系統。有研究發現小球藻和大腸桿菌共生系統中，大腸桿菌促進了小球藻的生物量增長，在處理模擬城市廢水時大大縮短了消耗營養物質的時間[5]。AMIN等[6]、張晶等[7]認為植物促生菌可以分解有機物、固定無機氮和提供CO2促進微藻的生長，而微藻又可提供O2促進菌的生長。

芽孢桿菌可以在養殖廢水中生長，并降解水體中氨氮和殘餌等[8]。JI等[9]發現小球藻和地衣芽孢桿菌共生系統對合成污水處理效果較好，COD、總溶解磷(TDP)和總溶解氮(TDN)的去除率分別為86.55%、80.28%和88.95%，而銅綠微囊藻和地衣芽孢桿菌共生系統處理效果明顯劣于小球藻和地衣芽孢桿菌共生系統。本實驗室在前期工作中構建多組藻菌共生系統，許多藻菌共生系統較純藻系統在凈化養殖廢水中并未表現出明顯優勢[10]，說明藻種和菌種的篩選是構建藻菌共生系統的關鍵因素。后續實驗中發現，補充少量葡萄糖與微量L-丙氨酸可提升藻菌共生系統對養殖廢水的處理效率[11]，說明藻菌共生系統對廢水的處理效果與廢水營養特性相關。

本研究以前期篩選的對養殖廢水污染物具有較好去除效率的萊茵衣藻(ChlamydomonasreinhardtiiCC-125)與凝結芽孢桿菌(BacilluscoagulansBS32)共生系統為研究對象，考察藻菌共生系統處理養殖廢水的過程中，微藻和細菌的生長以及污染物去除的變化，進一步篩選了共代謝碳源，考察少量葡萄糖和微量L-丙氨酸對萊茵衣藻-凝結芽孢桿菌共生系統處理養殖廢水的促進機制，為高效的藻菌共生系統在養殖廢水處理的規模化應用提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 萊茵衣藻和凝結芽孢桿菌

萊茵衣藻獲自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，于三醋酸磷酸酯(TAP)培養基中培養，培養條件為恒溫25 ℃，光暗周期12 h∶12 h，光照強度40 μmol/(m2·s)。

凝結芽孢桿菌獲自中南民族大學食品與生物工程研究所，接種于牛肉膏蛋白胨培養基中，培養條件為恒溫37 ℃，轉速200 r/min搖床培養。

1.2 廢水水質特征

實驗所用廢水為豬場養殖廢水，從武漢市郊區某養豬場獲得。使用殼聚糖為絮凝劑，海藻酸鈉為補充劑對豬場養殖廢水原液進行絮凝處理，沉淀3 h后取上清液用去離子水稀釋10倍，121 ℃高壓滅菌20 min后進行后續實驗。此時，養殖廢水中氨氮、TN、TP、COD分別為(20.0±0.5)、(80.0±1.3)、(22.0±1.3)、(1 000.0±18.6) mg/L。

1.3 藻菌共生系統構建

取對數生長期的萊茵衣藻和凝結芽孢桿菌，5 000 r/min離心5 min，去離子水洗滌3次，使用預處理后的養殖廢水重懸，制得初始細胞密度分別為7.6×108、1.0×108cfu/mL的萊茵衣藻和凝結芽孢桿菌懸液，將重懸的萊茵衣藻和凝結芽孢桿菌分別以10%(體積分數，下同)和1%的接種量接種到養殖廢水中，構建純藻系統與純菌系統，將10%萊茵衣藻和1%凝結芽孢桿菌同時接種到養殖廢水中，構建藻菌共生系統。將各培養系統放置于光照培養箱中，25 ℃下連續培養，光照強度40 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h∶12 h。培養過程中定時采集培養液樣品，5 000 r/min離心10 min，取上清液測定COD、氨氮、TN、TP。為考察添加營養物質后藻菌共生系統對養殖廢水凈化效能及藻菌生長的影響，分別向藻菌共生系統添加0.5 g/L葡萄糖以及0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L L-丙氨酸,相同條件下培養，定期采集培養液樣品測定水質指標及藻菌生長變化。

1.4 分析方法

1.4.1 水質指標的測定

COD采用COD試劑盒法測定；TN使用《水質 總氮的測定 堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》(HJ 636—2012)測定；氨氮使用《水中氨態氮的標準試驗方法》(ASTMD 1426-15)測定；TP使用《水質 總磷的測定 鉬酸銨分光光度法》(GB 11893—89)測定。

1.4.2 碳源利用的測定

Biolog EcoPlateTM微孔板可以通過微生物對碳源利用時所反映的顏色變化來檢測碳利用率，微孔板包含31種碳源，每種碳源有3個重復樣本。將Biolog EcoPlateTM微孔板預熱至25 ℃，分別取萊茵衣藻、凝結芽孢桿菌和藻菌共培養物，用微量移液器取125 μL移至微孔板中，加樣完畢蓋上板蓋，恒溫25 ℃下光照靜置培養，連續培養120 h，每隔24 h用酶標儀讀取590 nm處吸光度，記錄數據。

1.4.3 萊茵衣藻和凝結芽孢桿菌的生長測定

以每10倍為一個梯度將培養液稀釋104～106倍，涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養基上，37 ℃下孵育48 h，用平板計數法計算凝結芽孢桿菌的菌落數目。

取1 mL培養液與5 mL 90%(體積分數)丙酮溶液混合，4 ℃暗處理24 h。6 000 r/min下離心5 min，取上清液分別在630、647、664、750 nm處測量吸光度，根據式(1)計算葉綠素總質量濃度[12]：

Fx=[4.75(OD664-OD750)+11.89(OD647-OD750)+20.98(OD630-OD750)]VE/VS

(1)

式中：Fx為萊茵衣藻葉綠素總質量濃度，mg/L；OD664、OD750、OD647、OD630分別為上清液在664、750、647、630 nm處的吸光度；VE為混合溶液的體積，mL；VS為測量樣品的體積，mL。

1.4.4 葡萄糖含量測定

用3,5-二硝基水楊酸(DNS)通過比色法對樣品中的葡萄糖進行定量測定，具體操作方法參考文獻[13]。

1.4.5 葉綠素熒光強度測定

使用FMS-2便攜脈沖調制式熒光儀測量葉綠素熒光。取2 mL培養液在20 ℃室溫下暗適應15 min，通過測量光束確定葉綠素的固定熒光產量，并用飽和光脈沖測量最大熒光產量，根據式(2)計算葉綠素熒光參數：

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

(2)

式中：Fv為可變熒光產量；Fm為最大熒光產量；F0為固定熒光產量；Fv/Fm為光系統Ⅱ(PSⅡ)的最大光化學量子產量，反映PSⅡ的最大光能轉化效率。

2 結果與討論

2.1 各培養系統對養殖廢水的處理效果

純藻系統、純菌系統以及藻菌共生系統對養殖廢水的處理效果見圖1。

由圖1(a)可見，在連續5 d的培養過程中，藻菌共生系統對養殖廢水COD的去除率均高于純藻和純菌系統，培養初期純藻系統與藻菌共生系統對養殖廢水COD的去除效果接近，培養第2天純藻系統對養殖廢水COD去除率達到最大值63.26%，隨后開始逐漸降低。藻菌共生系統在培養第3天對養殖廢水COD去除率達到最高值65.28%，之后略微下降并總體趨于穩定。純菌培養系統對COD去除率基本保持上升趨勢，在培養第5天COD去除率與純藻系統接近。

由圖1(b)可見，純藻系統和藻菌共生系統對養殖廢水氨氮去除效果良好，且去除趨勢相似。純藻系統和藻菌共生系統在培養第5天對氨氮去除率均在60%以上，而純菌系統氨氮去除率僅在30%左右，遠低于純藻系統和藻菌共生系統。

由圖1(c)可見，純藻系統和藻菌共生系統在培養前4天TN去除率變化趨勢一致，培養第4天時TN的去除率分別為62.52%、64.88%。培養第5天純藻系統對TN的去除效率仍在上升，而藻菌共生系統對TN的去除有所下降。在純菌系統中，培養前4天養殖廢水TN去除率總體處于平穩狀態，第5天TN去除率大幅增加。

由圖1(d)可見，純菌系統培養初期TP濃度有所上升，TP去除率呈現負值，這可能是因為芽孢桿菌去除TP需要周期性循環，芽孢桿菌中積聚的磷存在釋放[14]，第3天后TP去除率逐漸上升。而純藻系統和藻菌共生系統對TP的去除效果接近，培養第5天時兩系統TP去除效率基本一致。

綜上可知，相較于純藻系統，藻菌共生系統對養殖廢水的凈化效果并未表現出明顯優勢，可能是養殖廢水的營養限制不利于藻菌共生系統中萊茵衣藻和凝結芽孢桿菌的生長。

2.2 碳源的選擇

以Biolog EcoPlateTM微孔板檢測藻菌的碳源利用情況，以期通過共代謝促進養殖廢水中有機物的降解。根據化學基團的性質，將Biolog EcoPlateTM微孔板上的31種碳源分為6個類別：酯類、羧酸、氨基酸、碳水化合物、胺類、醇類[15]。萊茵衣藻、凝結芽孢桿菌以及萊茵衣藻和凝結芽孢桿菌的藻菌混合對碳源的利用情況見圖2。

圖2 碳源的利用情況

由圖2可見，藻菌混合對6種碳源的利用情況由強到弱依次為酯類、碳水化合物、胺類、氨基酸、羧酸、醇類。相較單獨的萊茵衣藻而言，藻菌混合在保持對酯類高利用率的同時，大幅度提升了對碳水化合物的利用程度；而與單獨的凝結芽孢桿菌相比，藻菌混合后保持了對碳水化合物的高利用率，同時酯類利用率也得到了提高。總體看來，酯類和碳水化合物具備作為藻菌共代謝體系營養物的潛力。

在對31種碳源利用能力的分析中，藻菌混合對丙酮酸甲酯、D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的利用效率最高，其中兩種碳源為葡萄糖衍生物，說明萊茵衣藻-芽孢桿菌的藻菌共生系統可能對葡萄糖衍生物類碳源具有偏好性。SHI等[16]研究表明，通過添加葡萄糖、乳糖等生長基質可以加快微生物對難降解物質的降解速率，實驗結果為藻菌共生系統處理養殖廢水的共代謝碳源的選擇提供了方向。

2.3 葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統的影響

葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統處理養殖廢水的影響見圖3。

從圖3可以看出，添加0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L L-丙氨酸可以顯著提高藻菌共生系統對養殖廢水的處理效果，連續培養5 d后養殖廢水中COD、氨氮、TN、TP去除率分別從63.21%、60.68%、58.58%、80.49%提高到72.47%、91.07%、96.65%和89.29%。

圖3 葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統處理養殖廢水的影響

與無添加的藻菌共生系統相比，葡萄糖共代謝作用提升了藻菌共生系統對養殖廢水的處理效果。添加葡萄糖的藻菌共生系統COD去除率在培養第3天達到最高值(77.26%)，比無添加的藻菌共生系統提高11.98百分點；氨氮去除率也在培養第3天達到最大值68.65%，而無添加的藻菌共生系統氨氮去除率最大只有60.68%；無添加藻菌共生系統對TN的最大去除率僅為58.58%，而添加葡萄糖后TN最大去除率提高到67.16%；添加葡萄糖的藻菌共生系統在培養第1天TP去除率就快速升高并趨于平穩，在第4天高達95.91%，而無添加的藻菌共生系統TP的去除率最高為80.49%。進一步對同時添加葡萄糖和L-丙氨酸的藻菌共生系統進行分析，該培養系統對COD、TP的最大去除率分別為72.47%、89.29%，比僅添加葡萄糖的藻菌共生系統分別低4.79百分點、6.62百分點；但該系統對TN和氨氮去除效果提升明顯，TN和氨氮的最大去除率分別為96.65%、91.07%，與添加葡萄糖的藻菌共生系統相比，分別提高了29.49百分點、22.42百分點。可見，L-丙氨酸的添加未能提高菌藻共生系統對TP和COD的去除效果，但TN和氨氮的去除率明顯上升。凝結芽孢桿菌具備降解養殖水體中氨氮的潛能，說明L-丙氨酸可能對藻菌共生系統中微藻生長無明顯作用，但對凝結芽孢桿菌產生了促進作用。

2.4 葡萄糖和L-丙氨酸對萊茵衣藻的影響

葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統中萊茵衣藻的影響見圖4。

微藻生物量可以通過葉綠素含量的變化反映[17]。由圖4可見，藻菌共生系統中添加葡萄糖后，萊茵衣藻葉綠素含量明顯增加，即微藻生物量增加，葡萄糖作為輔助碳源促進了微藻生物量的積累，從而提高系統對營養物質的去除能力。L-丙氨酸等游離氨基酸也可以被微藻直接利用[18]，但同時添加葡萄糖和L-丙氨酸后萊茵衣藻的生物量要低于僅添加葡萄糖的藻菌共生系統。

圖4 葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統中萊茵衣藻生長的影響

葉綠素熒光可在不破壞活體微藻的情況下反映其光合活性，呈現光合作用中微藻光合生理狀況與環境脅迫關系[19-20]。根據測試結果，萊茵衣藻細胞葉綠素熒光參數Fv/Fm初始值為0.83，處理養殖廢水后Fv/Fm逐漸下降，但培養第5天時Fv/Fm仍穩定在0.6～0.8，添加葡萄糖以及添加葡萄糖和L-丙氨酸對萊茵衣藻光合活性無明顯影響，培養第5天時Fv/Fm分別為0.65、0.71，說明添加葡萄糖和L-丙氨酸后微藻仍可以保持良好的光合生理狀態，微藻自身光合活性并未受到影響。

2.5 葡萄糖和L-丙氨酸對凝結芽孢桿菌的影響

由圖5(a)可見，相比于無添加的藻菌共生系統，添加葡萄糖的藻菌共生系統凝結芽孢桿菌的細胞數量在培養第1天顯著增加，從1.21×105cfu/mL增加到2.97×105cfu/mL，而同時加入葡萄糖和L-丙氨酸的藻菌共生系統在培養第1天凝結芽孢桿菌細胞數量進一步提高到7.17×105cfu/mL，但在培養第2天，3個系統中凝結芽孢桿菌細胞數量均大幅下降。由圖5(b)可見，藻菌共生系統對葡萄糖利用速率很快，單獨或與L-丙氨酸同時添加葡萄糖后，藻菌共生系統中的葡萄糖在培養第2天分別降至0.092、0.116 g/L，此時藻菌共生系統中凝結芽孢桿菌幾乎不能生長，說明養殖廢水中的營養體系不利于凝結芽孢桿菌的生長，葡萄糖可以作為藻菌共生系統的輔助碳源但很快被消耗殆盡。在添加L-丙氨酸后，與僅添加葡萄糖的藻菌共生系統相比，萊茵衣藻生物量略微下降(見圖4)，可能因為微量L-丙氨酸作為凝結芽孢桿菌萌發劑促進了凝結芽孢桿菌萌發，消耗了部分葡萄糖，從而與萊茵衣藻形成了營養競爭關系。

圖5 葡萄糖和L-丙氨酸對藻菌共生系統中凝結芽孢桿菌生長的影響

葡萄糖能夠充當營養物質促進凝結芽孢桿菌的生長，而L-丙氨酸作為凝結芽孢桿菌的萌發劑，可與共萌發物如糖、核苷和其他氨基酸等加速凝結芽孢桿菌的萌發[21]， YASUDA等[22]研究表明，葡萄糖可以通過協同作用增強L-丙氨酸結合親和力，提升凝結芽孢桿菌萌發率。在本研究中，葡萄糖和L-丙氨酸添加顯著提高了藻菌共生系統對養殖廢水的處理效果，說明葡萄糖能促進藻菌的共代謝作用，微量L-丙氨酸極大程度地刺激了藻菌共生系統中凝結芽孢桿菌的生長，與上述文獻研究結果一致，并且適量的葡萄糖和L-丙氨酸不會對藻菌共生系統處理養殖廢水產生二次污染。

3 結 論

(1) 相較于萊茵衣藻的純藻系統，萊茵衣藻-凝結芽孢桿菌的藻菌共生系統對養殖廢水的凈化效果并未表現出明顯優勢。酯類和碳水化合物具備作為藻菌共代謝體系營養物的潛力，萊茵衣藻-凝結芽孢桿菌的藻菌共生系統可能對葡萄糖衍生物類碳源具有偏好性。

(2) 向藻菌共生系統中添加0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L L-丙氨酸可以顯著提高養殖廢水凈化效果，連續培養5 d后養殖廢水COD、氨氮、TN和TP去除率可分別從63.21%、60.68%、58.58%、80.49%提高到72.47%、91.07%、96.65%和89.29%。

(3) 在萊茵衣藻-凝結芽孢桿菌共生系統中，添加葡萄糖和L-丙氨酸后微藻仍可以保持良好的光合生理狀態，微藻自身光合活性并未受到影響。葡萄糖可以促進萊茵衣藻和凝結芽孢桿菌營養體生物量的增加，微量的L-丙氨酸可作為凝結芽孢桿菌的萌發劑，刺激凝結芽孢桿菌的萌發，加速藻菌共生系統對養殖廢水中有機物的利用。