山楂葉黃酮分離純化及抗氧化活性

宋璇，王汝華，于建麗，張睿，王志偉，萬守朋，李超，

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.食品生物技術教育部工程研究中心（天津科技大學），天津 300457；3.天津食品集團有限公司，天津 300074）

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）栽培歷史久遠，在我國已有兩千多年的食用和藥用歷史。山楂葉中含有豐富的黃酮類化合物、三萜類化合物、有機酸、維生素、生物堿等活性成分，具有極高利用價值[1-2]。研究表明，山楂葉提取物在調節血糖血脂、抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化及抗氧化等方面具有特殊功效[3-4]，以牡荊素及其糖苷、金絲桃苷、槲皮素等物質為代表的黃酮類化合物為其主要活性成分[5-7]。本研究以山楂葉為研究對象，利用超聲輔助提取法制備黃酮類化合物，探究其體外抗氧化活性，為山楂葉黃酮（hawthorn leaf flavonoids，HLF）作為食品功能因子的開發和應用提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂葉：天津薊州山區；蘆丁（HPLC≥98%）、氯化四唑氮藍（nitroblue-tetrazolium，NBT）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methyl sulfate，PMS）；還原型輔酶Ⅰ二鈉（NADH-Na2）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine ，DPPH）、2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、鐵氰化鉀、抗壞血酸（ascorbic acid，VC）、水楊酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇：天津市江天化工有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機（TGL-21）：四川蜀科儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5100B）：上海元析儀器有限公司；酶標儀（Multiskan FC）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超聲波清洗機（JP-031）：潔盟清洗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HLF的制備

取適量樣品加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，放置6 min，隨后與0.4 mL 10%的硝酸鋁溶液混合6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇溶液定容至10 mL，室溫（25℃）下反應15 min，測量OD500。以吸光度為縱坐標，黃酮濃度為橫坐標，得到蘆丁標準曲線方程：y=0.112 9x-0.004 154（R2=0.999）。

將100g低溫烘干山楂葉粉碎，過60目篩。采用超聲輔助提取法，選擇乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、料液比[1∶2、1∶6、1∶10、1∶14、1∶18（g/mL）]、提取時間（40、80、120、160、180 min）及提取溫度（20、30、40、50、60℃）為研究對象，以黃酮提取率為評價指標進行單因素試驗，提取率計算公式如下。

式中：Y 為黃酮提取率，%；m1為黃酮質量，g；m2為山楂葉質量，g。

根據單因素試驗，采用Design-Expert（10.0.7）軟件中的Box-Benhnken Design設計響應面試驗方案，優化提取工藝。試驗因素及水平見表1。

表1 自變量因素水平及編碼Table 1 Factor，level and code of independent variable

1.3.2 AB-8大孔吸附樹脂純化HLF

醇提物于4℃條件下冷藏24 h，再經過抽濾除雜、減壓濃縮得到山楂葉粗提物。通過靜態吸附-解吸試驗選擇樹脂，并經過動態吸附-解吸試驗明確最優純化工藝。

1.3.3 HLF的抗氧化活性

參考Oyaizu等[8]的方法，檢測不同濃度下HLF的總還原力，以“μg/mL VC當量”表示。根據Quaresma等[9]方法探究不同濃度下HLF清除DPPH·的能力；根據Xu等[10]研究方法，研究不同濃度下HLF清除ABTS+·的能力；參考萬聆[11]試驗方法，以NADH/PMS體系評價不同濃度下HLF清除O2-·的能力，根據Wang等[12]方法稍作修改，探究不同濃度下HLF對于·OH的清除能力。以蘆丁為陽性對照，空白組以等體積超純水代替樣品，背景組以等體積超純水代替除樣品外其余溶液。

2 結果與分析

2.1 單因素優化

2.1.1 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響

以乙醇體積分數為自變量，黃酮提取率為因變量探究兩者之間的關系，試驗結果見圖1。

如圖1所示，隨著乙醇體積分數提高黃酮提取率呈現先增大后減小的趨勢，在60%達到峰值。產生這種現象的原因是山楂葉黃酮一般以黃酮苷的形式存在，在一定范圍內增加乙醇濃度，可以通過破壞氫鍵和疏水作用力來提高游離黃酮含量[13]，因此選擇60%乙醇為HLF提取劑。

圖1 乙醇體積分數對黃酮提取率影響Fig.1 Influence of ethanol volume fraction on extraction yield of flavonoids

2.1.2 料液比對黃酮提取率的影響

通過改變料液比，探究提取劑用量對黃酮提取率的影響，試驗結果見圖2。

圖2 料液比對黃酮提取率影響Fig.2 Influence of material liquid ratio on extraction yield of flavonoids

如圖2所示，在試驗中增大提取劑添加量，可以促進固液兩相接觸，降低黃酮類化合物溶出阻力，提升傳質速率，在料液比為1∶14（g/mL）時，黃酮提取率達到最大值，（6.65±0.16）%。此時若繼續添加溶劑，不僅會使細胞外滲透壓升高，降低黃酮相對濃度；還會造成資源浪費并增加后續樣品處理難度，因此選擇1∶14（g/mL）作為最佳料液比。

2.1.3 提取時間對黃酮提取率的影響

超聲波在液體中傳播會形成巨大壓力，這種作用力可以破壞植物細胞壁，使胞內有效物質快速釋放，因此探究超聲輔助提取時間是優化提取工藝的關鍵環節，試驗結果見圖3。

圖3 提取時間對黃酮提取率影響Fig.3 Influence of extracting time on extraction yield of flavonoids

結合Noyes-Whitney方程[14]和圖3可知，提取時間為40min～120 min時，山楂葉黃酮提取率與提取時間呈正相關，并在120 min處達到最大值，隨后提取率隨時間增大而下降。這說明長時間超聲處理會破壞部分黃酮結構，導致熱敏組分降解轉化，因此選擇120 min為最佳提取時間。

2.1.4 提取溫度對黃酮提取率的影響

黃酮提取率隨提取溫度變化趨勢見圖4。

圖4 提取溫度對黃酮提取率影響Fig.4 Influence of temperature on extraction yield of flavonoids

如圖4所示，提取溫度在20℃～60℃時，提取率隨溫度的升高而顯著增大，50℃時達到最高點，繼續升溫黃酮提取率有所下降。適當提升溶劑溫度可加速布朗運動并改變溶質擴散系數，同時也可增強植物細胞壁滲透性、提高黃酮類化合物溶解度。但是，溫度過高會引發HLF氧化降解并加速溶劑揮發，進而影響黃酮的提取。因此，本試驗選取50℃為最佳提取溫度。

2.2 響應面優化

根據單因素試驗結果，選擇乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）為自變量，黃酮提取率為響應值，設計四因素三水平的Box-Benhnken試驗，響應面分析結果見表2。

由表2可知，擬合回歸方程：Y（黃酮提取率）=7.25+0.048A+0.52B-0.093C+0.17D+0.21AB+0.35AC-0.19AD-0.083BC+0.030BD-0.13CD-0.5A2-0.42B2-0.38C2-0.28D2。根據回歸模型顯著性分析表可以知，模型 P＜0.01，表明模型極顯著；失擬項 P=0.055 7＞0.05，說明殘差是由隨機誤差引起的，模型與實際數據擬合較好。表中一次項P值均小于0.05，表明選取的因素對響應值都具有顯著影響，影響程度為B（料液比）＞D（提取溫度）＞C（提取時間）＞A（乙醇體積分數）。交互項AB、AC、AD及 CD的P值均小于0.01，BC小于0.05，表明上述各因素兩兩交互作用顯著且與響應值存在非線性關系；BD大于0.05，表明料液比與提取溫度之間可能不存在復雜交互作用。

表2 響應面設計二階回歸方程顯著性分析Table 2 Analysis of variance for the second-order regression model

該模型相關系數R2=0.989 0，R2Adj=0.978 0，說明模型可以擬合98.90%的試驗數據并解釋97.80%的響應值變化。變異系數CV=1.16%，信噪比=37.30%，表明模型具有較高的精確度和可靠性，可以應用于黃酮提取率的分析和預測。

模型中的響應面和輪廓線可以表示不同因素對響應值的影響，結果如圖5所示。

圖5 響應面因素交互作用3D圖Fig.5 3D diagram of response surface factor interaction

圖5曲面均呈現開口向下的凸面，具有極高值點，該點即為兩因素交互后的最大黃酮提取率。3D圖在底面的投影可表現出兩因素交互影響，其中AB、AC、AD和CD等高線密集且形狀呈現橢圓形，說明上述交互作用均極顯著。由圖5a可知，AB兩因素交互作用極顯著，等高線多交于B軸，表明料液比對提取率影響更大，與顯著性分析結果一致。圖5e表示BD兩因素的相互作用關系，其中等高線稀疏且圖形分散，呈現圓形，證明料液比與提取溫度交互不顯著。曲面圖及等高線圖呈現結果與模型顯著性分析吻合，表明模型與試驗結果擬合較好，具有可行性和有效性。

通過軟件Design-Expert（10.0.7）進行擬合，得到HLF的最佳提取工藝：乙醇體積分數為60.230%，料液比為 1∶16.685（g/mL），提取時間為 109.885 min，提取溫度為54.011℃，黃酮提取率預測值為7.469%。考慮到可操作性，試驗將最優提取條件調整為乙醇體積分數 60%，料液比 1∶17（g/mL），提取時間 110 min，提取溫度54℃。實際測得的黃酮提取率為（7.53±0.15）%，相對誤差0.22%，與預測值基本吻合，說明該模型優化參數可靠，具有參考意義。

2.3 HLF純化

通過樹脂篩選及動態吸附-解吸試驗，明確HLF粗提物純化工藝：樹脂類型為AB-8；上樣量為2 BV，水洗體積為2 BV；除雜（10%乙醇溶液）體積為2 BV；洗脫劑（60%乙醇溶液）體積為4.5 BV。粗提物經過冷凍干燥后，固形物中黃酮質量分數為（27.25±1.21）%，經初步除雜后再通過AB-8的富集，黃酮質量分數提高至（85.61±0.72）%，約為純化前的3.14倍。

2.4 HLF體外抗氧化活性

2.4.1 總還原力

試驗采用鐵氰化鉀法測定HLF總還原能力，結果見圖6。

如圖 6 所示，HLF 濃度在 50 μg/mL～250 μg/mL時，總還原力隨HLF濃度增大而增大，呈現出劑量依賴關系，不同HLF濃度之間存在顯著性差異，250 μg/mL時達到（71.90±1.61）μg/mL VC當量。酚羥基可提供氫原子參與氧化還原反應，從而促進普魯士藍產生[10]。山楂葉黃酮結構中存在多個酚羥基，也因此具備較強的總還原力。

圖6 HLF總還原力Fig.6 Total reducing force of HLF

2.4.2 DPPH·清除能力

由于粗提物中蛋白質、多糖等物質也可能參與鐵氰化鉀還原反應，所以無法根據HLF總還原力判斷其自由基清除能力。純化后HLF純度為（85.61±0.72）%，仍含有部分雜質，因此探究其與自由基結合的難易程度有助于綜合評價該物質抗氧化活性[13]。HLF清除DPPH·能力見圖7。

圖7 HLF的DPPH·清除率Fig.7 DPPH·clearance rate of HLF

如圖7所示，HLF和蘆丁濃度在10μg/mL～100 μg/mL時，濃度與DPPH·清除率呈正相關，在100 μg/mL時，清除率達到（76.88±4.76）%和（62.47±2.37）%。蘆丁IC50為64.63μg/mL約為HLF（IC50為21.39μg/mL）的3.02倍，由此可見，HLF具有較好的清除DPPH·能力。

2.4.3 ABTS+·清除能力

HLF 和蘆丁濃度在 10 μg/mL～100 μg/mL 時，與ABTS+·清除率呈正相關，試驗結果見圖8。

如圖8所示，當HLF濃度為100 μg/mL時，清除率達到最大值，（94.73±1.36）%。在相同濃度下，HLF 與陽性對照作用效果接近，IC50分別為25.87 μg/mL及25.16 μg/mL，并未出現顯著性差異。研究表明，大部分黃酮類化合物可在較低濃度下呈現出極強的自由基清除能力，HLF可以通過提供電子、淬滅自由基并形成穩定的類黃酮中間體來終止自由基鏈式反應[15]。

圖8 HLF的ABTS+·清除率Fig.8 ABTS+·clearance rate of HLF

2.4.4 ·OH清除能力

通過水楊酸法對HLF和蘆丁結合·OH活性進行探究，試驗結果見圖9。

圖9 HLF的·OH清除率Fig.9·OH clearance rate of HLF

如圖9所示，隨著HLF和蘆丁濃度增大，體系里·OH不斷減少，當濃度為100 μg/mL時，清除率分別達到（91.10±4.64）%和（70.42±2.74）%。對比達到相同清除率兩者所用劑量可知，HLF（IC50為 23.75 μg/mL）的·OH清除能力要優于蘆丁（IC50為59.74 μg/mL）。烏欖葉黃酮在清除·OH試驗中IC50為54 μg/mL約為HLF的2倍[16]，杜仲葉黃酮在濃度為100 μg/mL時，抑制率為75%，作用效果低于HLF[17]。黃酮類化合物的結構與組成決定其抗氧化活性[18]，山楂葉黃酮富含牡荊素-2″-O-鼠李糖苷和牡荊素-4″-O-葡萄糖苷等活性物質，其結構中存在鄰二酚羥基。由于鄰二酚羥基可與半醌式自由基形成較穩定的分子內氫鍵，因此HLF表現出較強的·OH清除活性[18-19]。

2.4.5 O2-·清除能力

以NADH/PMS體系評價清除O2-·能力，試驗結果見圖10。

圖10 HLF的·清除率Fig.10 O2-·clearance rate of HLF

如圖 10所示，HLF與蘆丁濃度在 10 μg/mL～100 μg/mL時，以計量依賴的方式參與O2-·清除反應，且 HLF（IC50為 74.72 μg/mL）對于 O2-·清除能力略低于蘆丁（IC50為 48.09 μg/mL）。當濃度較高時，兩者作用效果接近，表明HLF具有較好的超氧陰離子清除能力。研究表明黃酮類化合物抗氧化活性與B環上的羥基數目呈現正相關，Dong等[20]在櫻桃中獲得6種黃酮單體，其中花青素-3-O-葡萄糖苷B環上存在2個羥基，而黃芪甲苷只有1個，前者清除自由基能力為后者的4倍，由此可見黃酮類化合物的結構與其抗氧化能力之間存在一定關系。HLF中含有金絲桃苷、槲皮素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等活性物質，B環均存在多個酚羥基，這可能是HLF清除自由基活性的重要依據。

3 結論

本試驗采用超聲輔助提取法，以較低功率對山楂葉進行多次提取，通過單因素及響應面試驗優化，將黃酮提取率提高至（7.53±0.15）%。在此基礎上經過AB-8大孔樹脂純化，HLF中黃酮質量分數達到（85.61±0.72）%，較純化前提高了58.36%。隨后對山楂葉黃酮抗氧化活性進行探究，通過比較總還原力及4種自由基清除作用可知，HLF對于 DPPH·、ABTS+·及·OH清除效果最好，O2-·效果略差。HLF作為高效、安全、無毒害作用的天然植物提取物，對于新型抗氧化劑及保健食品的開發具有重要意義。