超聲輔助提取紫蘇葉花色苷及其抗氧化活性研究

王月，趙彥巧，李建穎（天津商業大學生物技術與食品科學學院天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

紫蘇（Perilla frutescent（L.）Britt），是一種具有特殊香氣的藥食同源植物[1]，又名蘇子[2]，其紫蘇葉、紫蘇子、紫蘇梗均被《中國藥典》所收錄[3]。紫蘇葉含有許多營養物質，如酚類、氨基酸、花色苷、維生素和礦物質[4]，其莖、葉、根和種子等均可直接或加工后食用。研究表明，紫蘇具有良好的抗氧化性[5]、抗菌性[6]、抗過敏性[7]、止嘔[8]等多種生物學功能。花色苷作為一種天然色素，廣泛存在于葉片、花、果實等器官中并賦予其紅、橙、紫等不同顏色。目前已知的花色苷有二十多種，大量的研究結果表明，花色苷類化合物有一定的營養和藥理作用，具有良好的抗氧化[9]、抗癌[10]、抗腫瘤、抗炎殺菌、降血糖[11]等活性。目前，食品安全問題備受關注，花色苷作為一種安全性高、色澤鮮艷的天然可食用色素，廣泛應用于食品、藥品以及化妝品等行業。

目前，國內外對紫蘇葉花色苷提取及抗氧化活性的研究已有報道。Meng等[12]測定了從廣州、遼寧等地采集到的不同品種花色苷的含量為6 mg/g干重～7 mg/g干重。崔麗霞[13]采用超聲波輔助提取法提取紫蘇葉中的花色苷和多酚類化合物，提取量分別為6.44mg CGE/g和63.11mgGAE/g。此外 Gül?in 等[14]對紫蘇葉花色苷的活性研究發現，紫蘇葉花色苷對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等有很強的清除能力。超聲輔助作為提取天然物質的輔助手段，比傳統方法更節約時間，對遇熱不穩定的成分有保護作用，有利于節約能源[15-16]。本研究以紫蘇葉為原料，以酸化乙醇為溶劑采用超聲輔助提取紫蘇葉花色苷，分析多個因素對紫蘇葉花色苷提取量的影響，通過響應面試驗優化得到最佳提取工藝，并對紫蘇葉花色苷的體外抗氧化活性進行分析，為紫蘇葉花色苷的理論研究及其工業化運用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉：河北祁州中藥材種植園。

無水乙醇、濃鹽酸、無水乙酸鈉、氯化鉀（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度＞97.0%）：東京化成工業株式會社；Trolox（純度＞97.0%）：源葉生物科技有限公司；2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS]（純度＞98.0%）：上海易恩化學技術有限公司；過氧化氫（30%）：天津市北聯精細化學品開發有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平（AX224ZH）、pH 計（ST3100）：奧豪斯儀器有限公司；真空冷凍干燥機（LGJ-1A-50）：科儀創智（北京）科技發展有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2600）：島津儀器有限公司；多功能粉碎機（YB-2500A）：永康市速鋒工貿有限公司；高速冷凍離心機（CL5R）：湘儀離心機儀器有限公司；旋轉蒸發儀（RV10DIGITAL）：艾卡（廣州）儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫蘇葉前處理

取新鮮干紫蘇葉放入烘箱40℃烘6 h。取出干燥后的紫蘇葉，用多功能粉碎機打碎后過60目篩，4℃保存備用。

1.3.2 紫蘇花色苷提取工藝

紫蘇葉前處理→超聲輔助提取→離心取上清液→pH示差法測定上清液吸光度→計算提取量。

1.3.3 紫蘇葉花色苷提取量的測定

pH示差法[17]測定花色苷含量。

式中：ΔA=（A520nm(pH1.0)-A700nm(pH1.0)）-（A520nm(pH4.5)-A700nm(pH4.5)）；V為體積，mL；F為稀釋倍數；M為矢車菊素葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside）的分子量，449.2g/mol；ε 為摩爾消光系數26 900 L/（mol·cm）；l為比色皿厚度，cm；W為樣品質量，g。

1.3.4 單因素試驗設計

準確稱量1 g的紫蘇葉粉，加入不同濃度不同體積的酸化乙醇（pH2）進行超聲提取。以紫蘇葉花色苷的提取量為衡量指標，分別考察4個因素對花色苷提取量的影響：提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、乙醇體積分數（25%、30%、35%、40%、45%）和液料比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）]。每個處理做 3 個平行。

1.3.5 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面分析法（BBD模型）篩選出花色苷提取的最佳提取工藝條件，因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels for response surface design

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定

參考石雪萍等[18]的方法并稍作改動。取1 mL 0.1 mmol/L DPPH+1.5 mL無水乙醇+0.5mL不同濃度花色苷溶液于比色皿中混合均勻，置于25℃避光的環境中 30 min，測 A（517nm），計算公式如下。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量無水乙醇代替DPPH溶液的樣品的吸光度；A0為用等量無水乙醇代替花色苷溶液即空白對照溶液的吸光度。樣品的對照組為與其濃度相同的Trolox，每份處理做3個平行。

1.3.7 ABTS+自由基清除能力的測定

參考宋思圓等[19]的方法并稍作改動。配制ABTS母液：將245 μL（100 mmol/L）過硫酸鉀溶液置于10 mL容量瓶中，加入9.5 mL的7 mmol/L ABTS溶液，用超純水補齊至刻度，混合均勻，用錫紙包裹容量瓶在黑暗中靜置16 h。向pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中滴加 ABTS 母液，測得 A（734nm）=0.7±0.02，即得ABTS工作液。取3mLABTS工作液和0.03mL不同濃度花色苷溶液于比色皿中，混合均勻在黑暗環境中反應 6 min，測 A（734nm），計算公式如下。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量無水乙醇代替ABTS工作液的樣品的吸光度；A1為用等量無水乙醇代替花色苷溶液即空白對照溶液的吸光度。樣品的對照組為與其濃度相同的Trolox，每份處理做3個平行。

1.3.8 羥基自由基清除能力的測定

參考張玲等[20]的方法并稍作改動。分別配制4.5 mmol/L水楊酸、4 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2備用。反應體系為1 mL FeSO4+1 mL水楊酸+1 mL H2O2+1 mL不同濃度花色苷溶液，將溶液添加至比色皿中，混合均勻置于黑暗環境中 30 min，測 A（510nm），計算公式如下。

羥基自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量蒸餾水代替H2O2溶液的樣品的吸光度；A0為用等量蒸餾水代替花色苷溶液即空白對照溶液的吸光度。樣品的對照組為與其相同濃度的Trolox，每份處理做3個平行。

1.4 數據分析

試驗結果表示成平均值±標準差；用Origin 2019b作圖；用SPSS 25進行數據分析；響應面試驗用Design Expert 10.0分析。

2 結果與分析

2.1 單因素結果

2.1.1 提取溫度對花色苷提取量的影響

提取溫度對花色苷提取量的影響見圖1。

圖1 提取溫度對花色苷提取量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanin

由圖1可知，在30℃～50℃內隨著提取溫度的升高，紫蘇葉花色苷的提取量從626.54 mg/100 g增加到725.62 mg/100 g；再繼續升溫至70℃，花色苷的提取量又下降至655.71 mg/100 g，表明溫度對花色苷的溶解有一定的影響。升溫能加快分子運動[21]，提高溶液擴散速度，有助于提高乙醇對花色苷的溶解度；但花色苷耐熱性較差，提取溫度過高，花色苷結構受到破壞,降低花色苷得率。因此提取溫度選擇45、50、55℃進一步優化。

2.1.2 超聲時間對花色苷提取量的影響

超聲時間對花色苷提取量的影響見圖2。

圖2 超聲時間對花色苷提取量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on the yield of anthocyanin

由圖2可知，10 min～40 min隨著超聲時間的延長，紫蘇葉花色苷的提取量從511.65 mg/100 g增加到714.04 mg/100 g，并在40 min時達到最大。表明一定范圍內延長超聲時間對紫蘇葉中花色苷成分的溶出有一定的促進作用。但是時間延長到40min～50min，提取量不升反降，這可能是由于超聲波作用時間過長花色苷結構遭到破壞，花色苷被氧化降解使提取量呈下降趨勢。因此超聲時間選擇35、40、45 min進一步優化。

2.1.3 乙醇體積分數對花色苷提取量的影響

乙醇體積分數對花色苷提取量的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對花色苷提取量的影響Fig.3 Effects of ethanol volume fraction on the yield of anthocyanin

由圖3可知，在25%～40%范圍內，紫蘇葉花色苷的提取量隨著乙醇體積分數增大呈逐步上升的趨勢，在乙醇體積分數40%時花色苷提取量達到最大，為712.93 mg/100 g。這種情況可能是因為水分含量過多，乙醇含量過少，水溶性雜質在此體系中的溶解性較好，使花色苷溶出比例降低。隨著乙醇體積分數的增加，溶劑對細胞的滲透作用也會增大，有利于將花色苷從細胞中溶解釋放出來，但乙醇體積分數過大，提取液極性過低，花色苷溶出度和得率就會大幅下降[22]，導致花色苷含量不升反降。所以選擇35%、40%、45%的乙醇溶液進一步優化。

2.1.4 液料比對花色苷提取量的影響

液料比對花色苷提取量的影響見圖4。

圖4 液料比對花色苷提取量的影響Fig.4 Effects of liquid to material ratio on the yield of anthocyanin

由圖4可知，溶劑用量從5 mL增加到15 mL，紫蘇葉花色苷提取量增加了一倍，表明一定范圍內溶劑用量增加有利于原料中花色苷的傳質與擴散，提高花色苷溶出率，提升提取率。當液料比為15∶1（mL/g）時，提取量為 696.68 mg/100 g，液料比繼續增加到 25∶1（mL/g）時，提取量增幅不大。考慮到增加液料比會增加溶劑消耗，使提取液的體積太大，不利于后續濃縮步驟的進行。因此在優化試驗中選擇 10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）進一步優化。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗方案及結果

依據2.1的試驗結果，利用響應面軟件Design Expert 10.0設計四因素三水平的試驗，考察提取溫度（A）、超聲時間（B）、乙醇體積分數（C）和液料比（D）對結果的影響。試驗方案和結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface test

2.2.2 模型方程的建立與顯著性試驗

采用Design-Expert 10.0軟件對響應面試驗結果進行擬合回歸分析，得出花色苷提取量為目標函數的二次回歸方程Y=716.04-1.63A+1.80B-2.48C+4.53D+2.75AB-0.05AC-0.65AD-1.2BC-10.65BD-9.5CD-9.65A2-7.87B2-14.27C2-15.44D2。回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

由表3可知，模型F=148.27，表明該模型具有很高的精準度。模型P＜0.000 1，表明該模型達到高度顯著水平。在此情況下，一次項C、D是影響模型的重要參數，A、B是影響模型的參數；二次項BD、CD對模型影響很大，AB對模型有一定的影響，AC、AD、BC對模型的影響不顯著。各因素對花色苷提取量影響順序為D＞C＞B＞A。失擬項P＞0.05不顯著，說明該響應面模型存在的誤差較小，因此二次模型較合理。綜上表明，該模型設計的參數可以進行花色苷提取。

2.2.3 因素間交互作用的響應面分析結果

各因素交互作用對花色苷提取量影響的響應面圖見圖5。

等高線和3D響應曲面圖能比較直觀地反映4個因素對花色苷提取量的影響。等高線的形狀可以反映出交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反；從3D曲面圖來看，曲面越陡峭表明試驗因素對花色苷提取量影響越大，交互作用越顯著。由圖 5（b）、（c）、（d）可知 3D 響應曲面圖坡度平緩，等高線接近圓形，表明溫度和乙醇濃度、溫度和液料比、時間和乙醇濃度間的交互作用不顯著。圖5（a）、（e）、（f）等高線接近橢圓，3D 響應曲面圖陡峭，表明溫度和時間、時間和液料比、乙醇濃度和液料比間交互作用顯著。

圖5 各因素交互作用對花色苷提取量的影響Fig.5 The influence of the interaction of various factors on the extraction amount of anthocyanins

2.2.4 驗證試驗結果

經過Design-Expert 10.0軟件分析得到了紫蘇葉花色苷最佳提取工藝為提取溫度49.52℃，超聲時間37.42min，乙醇體積分數 39.23%，液料比 16.03∶1（mL/g），紫蘇葉花色苷提取量的理論值為716.75 mg/100 g。考慮實際操作修訂為提取溫度50℃，超聲時間37 min，乙醇體積分數40%，液料比16∶1（mL/g）。此條件下做驗證試驗，得到提取量為715.56 mg/100 g，與理論值716.75 mg/100 g相近，表明該模型有較好的預測作用，合理可行。

2.3 紫蘇葉花色苷對DPPH自由基清除能力的分析

紫蘇葉花色苷對DPPH自由基的清除能力見圖6。

圖6 紫蘇葉花色苷對DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of Perilla leaves anthocyanins

DPPH自由基具有單一電子，可以與抗氧化劑提供的電子或氫原子結合，發生反應使醇溶液從原來的紫色逐漸變淺，且與清除劑濃度呈一定的量效關系[23]。由圖6可知，隨著質量濃度從0.04 mg/mL增加到0.09 mg/mL，紫蘇葉花色苷清除DPPH自由基的能力從33.42%上升到84.42%，且上升趨勢大于Trolox。兩者在0.09 mg/mL時清除率均達到最大，分別為84.42%和97.22%，表明紫蘇葉花色苷能較好地清除DPPH自由基。

2.4 紫蘇葉花色苷對ABTS+自由基清除能力的分析

紫蘇葉花色苷對ABTS+自由基的清除能力見圖7。

圖7 紫蘇葉花色苷對ABTS+自由基的清除能力Fig.7 ABTS+radical scavenging activity of Perilla leaves anthocyanins

從圖7可知，隨著質量濃度增加，Trolox和紫蘇葉花色苷的清除率均上升，對照組的上升趨勢大于試驗組，且同一濃度下Trolox的清除率大于紫蘇葉花色苷。當質量濃度為0.7 mg/mL時紫蘇葉花色苷和Trolox對ABTS+自由基的清除效率均達到最大，分別為47.85%和99.74%，表明紫蘇葉花色苷有一定的ABTS+自由基清除能力，可作為抗氧化成分可與ABTS+反應，使原本藍綠色的反應體系褪色，終止自由基的連鎖反應，從而清除或抑制ABTS+自由基生成。

2.5 紫蘇葉花色苷對羥基自由基清除能力的分析

紫蘇葉花色苷對羥基自由基的清除能力見圖8。

羥基自由基對人體危害較大，當羥基自由基產生與清除不平衡時，會影響機體正常生理功能[24]。由圖8可知，紫蘇葉花色苷和Trolox對羥基自由基的清除率與質量濃度成正比，但紫蘇葉花色苷的清除能力低于Trolox。當質量濃度為1.1 mg/mL時紫蘇葉花色苷和Trolox對羥基自由基的清除效率均達到最大，分別為51.27%和96.68%。表明紫蘇葉花色苷有一定的羥基自由基清除能力，紫蘇葉花色苷作為供氫體與氧化還原反應產生的羥基自由基結合，從而保護機體免受羥基自由基的損壞。

圖8 紫蘇葉花色苷對羥基自由基的清除能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of Perilla leaves anthocyanins

3 結論

采用超聲輔助提取紫蘇葉花色苷，用酸化乙醇作為提取溶劑，在單因素試驗的基礎上，通過響應面試驗確定了最佳提取工藝條件。試驗結果表明，各因素對花色苷提取量的影響順序為料液比＞乙醇體積分數＞超聲時間＞提取溫度。最佳工藝條件為乙醇體積分數 40%、液料比 16∶1（mL/g）、超聲時間 37 min、提取溫度50℃，此時紫蘇葉花色苷提取率最高，達到了715.56 mg/100 g。體外抗氧化活性試驗表明，紫蘇葉花色苷對3種自由基都具有良好的清除能力，且其抗氧化能力與紫蘇葉花色苷濃度總體呈正比，紫蘇葉花色苷對DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基的清除率分別達到84.42%，47.85%和51.27%。

綜上所述，超聲輔助提取對紫蘇葉花色苷的優化工藝可行，試驗結果穩定可靠，具有較強的體外抗氧化能力，試驗結果為紫蘇葉花色苷在食用藥用方面的開發提供了一定技術支持和理論數據參考。