響應面法優化刺五加果酒的釀造工藝

賈金輝，柴虹宇，程貴蘭，蔡智軍，張海濤，田曉玲，梁文珍

（遼寧農業職業技術學院，遼寧 營口 115009）

刺五加主要于分布東北、華北等地區，尤其在東北山區及半山區儲量豐富，其根莖和根為名貴中藥材，又稱五加參[1-2]。刺五加的葉和果實既可以食用也可以藥用，刺五加果營養豐富，其果實含有人體全部的必需氨基酸和Fe、Se等多種微量元素以及蔗糖、果糖、多糖等可發酵性糖，其中刺五加果實中的多糖和根莖的多糖類似，具有提高免疫力的功能[3]；同時刺五加果具有鎮定安神以及抗疲勞的作用，能夠緩解乏力、健忘、心悸等癥狀[4-6]。由于刺五加野生資源豐富，且耐寒、耐貧瘠，種植簡單易行，推廣刺五加的種植，能在一定程度上提高山區農民的收入[7-9]。

目前刺五加資源的利用主要是在刺五加根莖的提取入藥方面，而刺五加果的利用方面研究較少[10]。刺五加果含有蔗糖等可發酵性糖、豐富的果香、較高的出汁率以及氮源，能夠釀制果酒[11-13]。釀造刺五加果酒可以充分利用營養豐富的刺五加果實，增加刺五加的附加值，對刺五加果的深加工和野生資源的多方面利用具有重要意義。本文以刺五加果為原料，研究釀造刺五加果酒，以酒精度和感官評分為評價指標，進行料水比、果膠酶添加量、發酵溫度和接種量4個單因素試驗，在確定發酵溫度的基礎上，進行其他3個因素的響應面優化試驗，確定刺五加果酒的最佳釀造工藝，為刺五加果酒開發和產業化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺五加（新鮮）：市售；釀酒酵母、果膠酶（10000U/mL）、焦亞硫酸鉀（食品級）：意大利英納帝斯公司；白砂糖（食品級）：中糧糖業遼寧有限公司。

1.2 儀器與設備

RHB-02手持糖度計：上海奮業光電儀器有限公司；JH-03S電子稱、JH120-3電子天平：北京京衡偉業科技有限公司；HH-M4恒溫水浴鍋：上海赫田科學儀器有限公司；JCP-5除梗破碎機：新鄉市領先輕工機械有限公司；BIOQ-6009MINIQ生物發酵罐：匯和堂生物工程設備（上海）有限公司；JLM-02膜過濾機：煙臺帝伯仕自釀有限公司；GDP12-9灌裝機：青州市鵬程包裝機械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺五加果酒釀造工藝流程

刺五加鮮果→分選→清洗→除梗破碎→加水→加果膠酶→加硫→調糖→浸漬→接種酵母→酒精發酵→過濾→灌裝→刺五加果酒。

1.3.2 操作要點

刺五加果預處理：除去腐爛發霉的刺五加果，清洗選好的刺五加果實，洗凈控水后，將其倒入除梗破碎機中，先去除刺五加果梗再將果實進行破碎，這樣避免果梗中的不良物質進入果酒[14]，將得到刺五加果醪導入浸漬罐中待用。

加水：向浸漬罐中加入純水，刺五加果與純水的比例為3∶2（kg/L），因為刺五加果辛味比較重，添加適量的水有利于減少辛味，并保持刺五加果中營養功效[15]。

加果膠酶和硫：向刺五加果醪中加入果膠酶，操作步驟是稱量果膠酶調節濃度至80 mg/L左右，然后加入20℃純水，攪拌均勻將其溶解，加入刺五加果醪中，再進行充分攪拌，使其混合均勻。因為刺五加果中果膠物質含量較高[16]，加入適量的果膠酶有利于提高刺五加果的出汁率以及提高果酒產品的穩定性[17]。加入果膠酶12 h后向刺五加果醪中繼續添加焦亞硫酸鉀，操作步驟是稱取80 mg/L的焦亞硫酸鉀，向其中加入純水并攪拌溶解，待沒有焦亞硫酸鉀顆粒即溶解充分后，倒入刺五加果醪中，攪拌均勻。添加焦亞硫酸鉀的目的是殺死有害細菌并且抑制非釀酒酵母的活力，從而防止刺五加果酒染菌破敗，使發酵順利進行[18]。

調糖及浸漬：刺五加果加水稀釋后，果醪的糖度隨之降低，為了達到發酵所需的酒精度，需要額外添加白砂糖。加糖量計算方法為1%vol的酒精度可由18 g/L的蔗糖可轉化而成，按計算結果稱取白砂糖調節濃度至80g/L，并用果汁充分溶解糖，然后將溶解好的糖汁混合液導入刺五加果醪中，并進行充分的攪拌。調好糖后，果醪在浸漬罐浸漬一段時間，再啟動發酵，目的是讓刺五加果中的營養物質充分的浸漬出來以及讓果膠酶充分的分解刺五加果中的果膠物質，克服果膠的高黏度[17，19]，確保發酵的順利進行。具體操作為浸漬的溫度20℃保持48 h。

酵母接種及酒精發酵：稱取200 mg/L的釀酒酵母，將其加入適量的35℃左右的刺五加果汁中攪拌均勻，并在35℃的水浴鍋中保溫度25 min，待酵母升起高泡后即為活化成功，再將酵母菌液從水浴鍋中冷卻至室溫（20℃），導入果醪中并攪拌均勻[19-20]。接種成功后，控制24℃的溫度進行酒精發酵，發酵期間刺五加酒帽需壓入發酵液中3次/d，并測定相對密度，當相對密度為0.995以下時說明發酵結束，大概用時8 d左右，接種量取決于發酵溫度，溫度越高發酵時長越短[21-22]。

過濾及灌裝：發酵結束后，需要立即分離皮渣，防止皮渣下沉與酒液混合渾濁，為了獲取澄清的刺五加果酒，還需要過濾處理，先將酒液經過20 μm澄清紙板進行粗濾，然后再經過0.22 μm除菌膜進行精濾，從而達到無菌的狀態，最后在無菌車間進行灌裝。

1.3.3 單因素試驗及響應面試驗

在料水比 3∶2（kg/L）、果膠酶添加量 80 mg/L、發酵溫度24℃、接種量200 mg/L的初始發酵條件基礎上，分別改變料水比[1∶2、1∶1、3∶2、2∶1、5∶2（kg/L）]、果膠酶添加量（40、60、80、100、120 mg/L）、發酵溫度（20、22、24、26、28 ℃）、接種量（100、150、200 、250、300 mg/L），進行單因素試驗，考察各個指標對刺五加果酒的酒精度及感官評價的影響。

通過單因素試驗，選取顯著性強的料水比（A）、果膠酶（B）和接種量（C）為考察變量，以刺五加果酒的酒精度（Y）為響應值，通過Design Expert 12軟件進行三因素三水平試驗，見表1。

表1 響應面優化刺五加果酒釀造工藝的因素和水平Table 1 Optimization of factors and levels in brewing process of Acanthopanax senticosus wine by response surface methodology

1.3.4 分析檢測

酒精度：參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中酒精計法；揮發酸：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法[23]；總二氧化硫：參照GB/T 15038—2006中直接碘量法；微生物指標：參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》測定菌落總數[24]，參考GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》測定大腸菌群數[25]。

感官評判：參照GB/T 15038—2006中葡萄酒感官要求，設立20人的專家小組，建立刺五加果酒的評價體系[23]，感官評價標準見表2。

表2 刺五加果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of Acanthopanax senticosus wine

1.4 數據處理

采用Excel 2007進行數據處理和制作圖表，采用Design-Expert 12進行響應面試驗設計和分析。

2 結果與分析

2.1 優化刺五加果酒釀造工藝的單因素試驗

2.1.1 料水比對刺五加果酒品質的影響

由于刺五加果辛味比較重，添加適量的水有利于減少辛味，并保持刺五加果中營養成分的功效[15-16]，料水比對刺五加果酒的品質起著十分重要的作用。料水比對刺五加果酒品質的影響如圖1所示。

圖1 料水比對刺五加果酒品質的影響Fig.1 Effect of material water ratio on the quality of Acanthopanax senticosus wine

圖1結果表明，隨著原料比例的增加，刺五加果酒的酒精度逐步升高，原因是刺五加果實含有可發酵性糖，隨著原料比例的增加，可發酵性糖也越多，產生的酒精度也越高；感官評分卻隨著料水比的增加呈先升高后降低的趨勢，且在料水比3∶2（kg/L）時達到最高值，因為刺五加果辛味比較重，加入少量的水可以稀釋這種味道，從而使感官評分增加，但過量的水會使刺五加果酒變得寡淡、顏色及營養物質降低，導致感官評分降低。

2.1.2 果膠酶對刺五加果酒品質的影響

刺五加果中果膠物質含量較高[16]，加入適量的果膠酶有利于提高刺五加果的出汁率以及提高果酒產品的穩定性[17]，如圖2所示。

圖2結果表明，果膠酶在40 mg/L～60 mg/L時，酒精度逐漸增高，原因是果膠酶分解刺五加果中的果膠物質，提高出汁率，從而發酵變得順利和徹底，但果膠酶達到80 mg/L后效果不再明顯；隨著果膠酶的增加，感官評分先升高后降低，原因是適量的果膠酶使得刺五加果酒變得澄清及穩定，但是果膠酶超過100 mg/L后其因過量殘留在刺五加果酒中，影響酒液的澄清度及口感。

圖2 果膠酶對刺五加果酒品質的影響Fig.2 Effect of pectinase on the quality of Acanthopanax senticosus wine

2.1.3 發酵溫度對刺五加果酒品質的影響

發酵溫度對刺五加果酒的酒精產率和香氣口感有重要影響，如圖3所示。

圖3 發酵溫度對刺五加果酒品質的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of Acanthopanax senticosus wine

圖3結果表明，隨著發酵溫度的升高，酒精度和感官評分都呈先升高后降低的趨勢，且在24℃都達到最高值，原因是適宜的溫度有利于酵母的繁殖和發酵。溫度低于22℃，酵母啟動慢，發酵遲緩，酒精產率較低，且較長的發酵時間會造成微生物侵染，導致酒體渾濁甚至破敗。溫度高于24℃，酵母菌的活動開始受到影響，可能引起發酵的中止，導致揮發酸含量上升、酒體質量下降。由此可知發酵溫度為24℃左右為宜。

2.1.4 酵母接種量對刺五加果酒品質的影響

酵母接種量直接影響刺五加果酒的發酵進程及感官品質，如圖4所示。

圖4結果表明，當酵母接種量低于150 mg/L時，酒精度和感官評分都較低，可能由于接種量不足，導致發酵不完全，產酒率較低，同時由于發酵緩慢，致使刺五加果汁容易氧化、甚至受到微生物侵染，影響口感。但當接種量超過250 mg/L時，酒精度增加不再明顯，同時大量的酵母菌會使刺五加果酒產生酵母味，影響香氣和口感[26]。

圖4 接種量對刺五加果酒品質的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the quality of Acanthopanax senticosus wine

2.2 優化刺五加果酒釀造工藝的響應面試驗

2.2.1 模型建立與方差分析

通過單因素試驗，確定發酵溫度為24℃最佳，選取另外三個更為顯著性因素，按照表1進行優化釀造工藝的響應面試驗，試驗設計和結果見表3。

表3 刺五加果酒釀造工藝Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Box Behnken experimental design and results of Acanthopanax senticosus wine technology

利用Design Expert 12軟件對表3的試驗數據作回歸分析，以刺五加果酒的酒精度為響應值，構建刺五加果酒釀造工藝參數的回歸方程：Y=11.66+0.312 5A-0.137 5B+0.1C-0.1AB-0.125AC-0.175BC-0.63A2-0.08B2-0.805C2。

對該方程進行響應面試驗回歸模型的方差分析，結果見表4。

表4 響應面試驗回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表 4可知，模型呈極顯著（P＜0.000 1），說明刺五加果酒的酒精度與料水比、果膠酶添加量和接種量關系顯著；失擬項P值為0.090 8＞0.05，不顯著，說明構建的回歸模型不失擬，成功；離散系數=1.29%，說明試驗的精確度高且可靠性強；刺五加果酒釀造工藝相關系數R2=0.977 2，說明該模型試驗誤差小，調整系數R2Adj=0.947 9，表示該模型能夠解釋94.79%的響應值變化；信噪比=18.218 1＞4，說明該模型很適合刺五加果酒釀造工藝試驗的預測。通過顯著性檢驗可知，一次項A和二次項A2、C2呈極顯著性，一次項B和二次項BC呈顯著性，其他項則呈不顯著性。因為F值越大，表示該因素影響力越強，由表4可知對刺五加果酒釀造工藝影響的強弱順序：料水比＞果膠酶添加量＞接種量。

2.2.2 響應曲面分析與討論

對刺五加果酒的酒精度有顯著影響的三個因素的響應面及等高線見圖5。

圖5 各因素兩兩交互作用對刺五加果酒酒精度影響Fig.5 The effect of pairwise interaction of various factors on the alcohol content of Acanthopanax senticosus wine

兩兩因素交互作用的強弱可通過等高線得出，如果等高線呈橢圓形則表明兩個因素的交互作用顯著，如果等高線呈圓形則表明兩個因素的交互作用不顯著[27]。由圖5可知，接種量和果膠酶添加量兩個因素的交互作用等高線趨于橢圓，故對刺五加果酒的酒精度影響顯著；料水比和果膠酶添加量交互作用以及料水比和接種量的交互作用等高線趨于圓形，故對刺五加果酒感官評分影響不顯著。

根據所建模型的回歸方程求出最優解，得到刺五加果酒釀造工藝的最佳條件：料水比為1.656∶1（kg/L），果膠酶添加量為60 mg/L，接種量為207.336 mg/L，得到刺五加果酒的酒精度為11.802%vol。

2.2.3 最優釀造工藝驗證

根據實際操作將料水比修改為1.7∶1（kg/L）、接種量修改為207 mg/L，果膠酶添加量不變仍為60 mg/L，按照此工藝參數得到實際刺五加果酒的酒精度為11.9%vol，與試驗最優解的酒精度十分接近，說明為刺五加果酒釀造工藝所構建的響應面模型真實準確，有很強的參考價值[28]。

2.2.4 刺五加果酒質量指標及微生物指標

在最佳釀造工藝條件下釀造出的刺五加果酒，顏色呈紅色、果香濃郁、酒體豐滿、風格獨特，感官評分高達94，酒精度為11.9%vol，揮發酸為0.3 g/L，總硫為42 mg/L；進行微生物指標檢驗得到大腸菌群＜3個，菌落總數為12個，刺五加果酒的質量指標和微生物指標均符合果酒行業標準。

3 結論

本研究通過單因素試驗確定刺五加果酒釀造工藝影響顯著性較強的因素，然后采用響應面分析法對其進行優化。確定最佳工藝為料水比1.7∶1（kg/L），果膠酶添加量60 mg/L，接種量207 mg/L，發酵溫度24℃。得到刺五加果酒顏色呈紅色、果香濃郁、酒體豐滿、風格獨特，酒精度為11.9%vol，感官評分為94，揮發酸為0.3 g/L，總硫為42 mg/L，進行微生物指標檢驗得到大腸菌群＜3個，菌落總數為12個，符合果酒行業標準。