響應面法優化酶解草菇蛋白制備抗氧化肽工藝

游慶紅，陳梅琳，趙增東，李彥良，鄧永智，周孟婷，尹秀蓮*，羅楚平

（1.淮陰工學院化工學院，江蘇 淮安 223003；2.淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003）

機體的氧化應激是許多疾病如糖尿病、癌癥和炎癥疾病的誘因，此外，脂質氧化會引起很多食物的變質[1-2]。自由基介導的氧化應激、脂質氧化得到廣泛關注，尋找可以顯著抑制氧化反應的抗氧化劑成為研究的熱點[3-4]。由于一些合成抗氧化劑，如丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯和叔丁基對苯二酚過量添加會產生毒副作用，開發安全有效的天然抗氧化劑具有重要的研究意義[5-6]。Tironi等[7]研究了莧菜蛋白抗氧化肽在植物油熱氧化過程中的抗氧化作用，將抗氧化肽以10%的濃度分散在油中，結果表明抗氧化肽對油有高溫熱穩的作用。石麗梅等[8]研究了玉米抗氧化肽對中式香腸氧化穩定性的影響，將玉米抗氧化肽拌入原料制備香腸，結果表明2%玉米肽的抗氧化性要顯著高于0.01%丁基羥基茴香醚。

抗氧化肽一般由2個～20個氨基酸組成，能夠延緩或防止食物系統中的脂質和蛋白質氧化，并保護身體免受與炎癥、癌癥和衰老等疾病相關的氧化損傷[9-10]。多肽及蛋白質酶解物具有低致敏性、高活性、易吸收和安全等特點，相較于蛋白質更有益于人體健康[11]。抗氧化肽通常存在于無活性或活性較低的大分子蛋白中，可以通過蛋白酶的酶解制備[12]。酶法制備抗氧化肽反應條件溫和、制備效率高，是目前常用的方法[13]。

草菇（Volvariella volvacea），又名麻菇、蘭花菇等[14-15]，草菇的味道鮮嫩可口、含有豐富的營養物質和活性物質。近年來，國內外對草菇研究主要集中在其多糖的提取純化與生物活性等方面[16]，而對草菇蛋白的研究較少，每100g草菇含蛋白質2.68g，其蛋白質含有18種氨基酸，其中必需氨基酸占40.47%～44.47%[17-18]。草菇蛋白是一種優質的植物蛋白質資源，可以作為優良的抗氧化肽制備原料，本研究以草菇為原料，提取制備草菇蛋白，篩選酶解制備草菇蛋白抗氧化肽的最適酶，并采用響應面設計對酶解工藝進行優化，為酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的工業化生產提供理論依據，也為日后的進一步深入研究提供方向和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草菇：市售；木瓜蛋白酶（酶活100 U/mg），中性蛋白酶（酶活 200 U/mg）、堿性蛋白酶（酶活 200 U/mg）、胃蛋白酶（酶活250 U/mg）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：sigma 公司；2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：上海碧云天生物技術有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、FeSO4、H2O2、水楊酸、鐵氰化鉀：國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

Q-250B高速多功能粉碎機：上海冰都電器有限公司；YB-FD-1冷凍干燥機：上海億倍實業有限公司；D-8紫外可見分光光度計：南京菲勒儀器有限公司；FA1004N電子天平：上海菁華科技儀器有限公司；5418小型臺式高速離心機：德國艾本德公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 草菇蛋白粉的制備

將草菇55℃低溫干燥8 h，粉碎成粗粉，過40目篩。稱取5 g草菇粉，加50 mL去離子水，用0.5 mol/L NaOH調節pH8.0，充分混合均勻，于轉速8 000 r/min下離心15 min，取上清液，用HCl調pH4.5，靜置10 min使蛋白初步沉降，于8 000 r/min的轉速下離心20 min。將濕蛋白取出，進行冷凍干燥，得草菇蛋白粉。

1.2.2 蛋白酶篩選

分別采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶進行酶解試驗。設定酶解的反應條件為料液比 1∶10（g/mL），加酶量均為 5 000 U/g，酶解時間 6 h，并調節pH值及溫度為各蛋白酶水解最適條件。分別于酶解 10、30、60、120、180、240、300、360 min 取樣，沸水加熱5 min對蛋白酶滅活，冷卻后測定酶解溶液的DPPH自由基清除率，篩選出最佳蛋白酶。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 酶濃度對制備抗氧化肽的影響

固定底物濃度為4%，pH6.0，酶解時間120 min，酶解溫度55℃，以DPPH自由基清除率為指標，選取木瓜蛋白酶濃度0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，考察酶濃度對酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響。

1.2.3.2 酶解溫度對制備抗氧化肽的影響

固定底物濃度為4%，pH6.0，酶解時間120 min，酶濃度1.0%，以DPPH自由基清除率為指標，選取酶解溫度為 40、45、50、55、60 ℃，考察酶解溫度對酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響。

1.2.3.3 酶解時間對制備抗氧化肽的影響

固定底物濃度為4%，pH6.0，酶解溫度50℃，酶濃度1.0%，以DPPH自由基清除率為評價指標，選取酶解時間為 60、120、180、240、300 min，考察酶解時間對草菇蛋白制備抗氧化肽的影響。

1.2.3.4 底物濃度對制備抗氧化肽的影響

固定pH6.0，酶解溫度55℃，酶濃度1.0%，酶解時間180 min，以DPPH自由基清除率為評價指標，選取底物濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，考察底物濃度對酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響。

1.2.4 響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計的響應面分析方法，以酶濃度、底物濃度、酶解溫度及酶解時間為自變量，DPPH自由基清除率為響應值，對酶解工藝進行進一步優化。各因素水平及編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Levels and process variables used for response surface analysis

1.2.5 DPPH自由基清除率試驗

參照Jang等[19]的方法，并稍作改動。取2 mL酶解液于試管中，加1 mL 0.2 mmoL/L DPPH溶液，劇烈振蕩搖勻，放置在暗處反應30 min，用紫外分光光度計在517 nm測定吸光度為A1；移取1 mL乙醇溶液和2 mL酶解液混合搖勻測得吸光度為A2；移取2 mL乙醇溶液和1 mL DPPH為A3；2 mL水與2 mL乙醇混合溶液調零。DPPH自由基清除率計算公式如下。

1.2.6 羥基自由基清除率

參照Zhang等[20]的方法測定。配制8 mmol/L的FeSO4溶液、20 mmol/L的H2O2及3 mmol/L水楊酸。取0.335 mL樣品與8 mmol/L FeSO40.1 mL、水楊酸0.335 mL及H2O20.08 mL混勻，37℃保溫30 min后流水冷卻，加入蒸餾水0.15 mL，5 000×g離心10 min，取上清液于510 nm波長處測定吸光值，分別以蒸餾水代替樣品和H2O2溶液作為空白組和對照組。羥基自由基清除率計算公式如下。

式中：A0為空白組吸光值；A1為樣品組凈吸光值。

1.2.7 還原能力的測定

取待測樣品溶液，加入pH6.6、濃度0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液3.0 mL，50℃水浴加熱20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，5 000×g離心10 min，取上清液3 mL，加入蒸餾水3 mL混合，加入0.1%的FeCl3溶液0.5 mL，混勻，25℃靜置15 min，以去離子水代替樣品溶液作為空白，在700 nm波長下測定吸光度[21]。

1.2.8 ABTS+自由基清除能力

分別取5 mL 7.4 mmol/L ABTS溶液和3.6 mmol/L過硫酸鉀溶液，混合均勻，25℃避光反應12 h，得到ABTS+自由基儲備液。取樣品液0.4 mL于試管中，加入3.6 mL ABTS儲備液，25℃避光反應6 min，于734 nm處測定吸光值，以去離子水替代樣品做空白對照。ABTS+自由基清除率計算公式如下[22]。

ABTS+自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0為空白對照吸光值；A1為樣品與ABTS反應后吸光值；A2為樣品自身的吸光值。

1.3 數據處理

試驗數據以平均值±標準差表示（n=3），采用origin pro 8.0和Design-expert軟件對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 酶的篩選

不同酶處理對DPPH自由基清除率的影響的試驗結果見圖1。

圖1 不同酶處理對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different enzyme treatment on DPPH free radicals scavenging rate

由圖1可知，4種蛋白酶對產物DPPH自由基清除率的影響差異較大，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶水解產物抗氧化活性較強，其中木瓜蛋白酶在酶解180min時，DPPH自由基清除率可達到約80%，隨著水解的繼續進行，DPPH自由基清除率緩慢下降。堿性蛋白酶與胃蛋白酶水解產物DPPH自由基清除率較低，隨水解時間延長呈緩慢上升的趨勢，當水解時間達到240min后，DPPH自由基清除率基本趨于恒定。以DPPH自由基清除率為指標，本試驗選擇有最高清除率的木瓜蛋白酶為最佳酶。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 酶濃度對制備抗氧化肽的影響

木瓜蛋白酶濃度對酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響結果見圖2。

圖2 酶濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on DPPH free radicals scavenging rate

由圖2可知，酶濃度在0.4%～1.0%時，DPPH自由基清除率迅速上升，酶濃度為1.0%時，清除率達到80.62%。當酶濃度在1.0%～1.2%時，清除率下降。其原因可能是在一定濃度范圍內，隨著酶濃度逐漸增加，底物蛋白水解越充分，生成的抗氧化肽量越多，但隨著酶濃度的進一步增加，部分抗氧化肽會被過度水解成不具有抗氧化活性的更短小的肽或氨基酸，使酶解液對DPPH自由基的清除率降低。選取酶濃度1.0%較適宜。

2.2.2 酶解溫度對制備抗氧化肽的影響

酶解溫度對酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響結果見圖3。

圖3 酶解溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of different enzymolysis temperature on DPPH free radicals scavenging rate

由圖3可知，在酶解溫度在40℃～55℃時，DPPH自由基清除率隨溫度升高而增加；在55℃時清除率達到80.22%。當酶解溫度在55℃～60℃時，清除率下降。可能是溫度較低時，隨著溫度逐漸升高，酶活性逐漸增強，酶解速率逐漸加快，達到酶最適溫度時，DPPH自由基清除率達到最大值。但當酶解溫度超過了酶的最適溫度時，過高的溫度會使得酶的活性會逐漸下降，甚至是失活，導致酶解產物含量降低，清除率下降。選取50℃為較適宜的酶解溫度。

2.2.3 酶解時間對制備抗氧化肽的影響

酶解時間對酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響結果見圖4。

圖4 酶解時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on DPPH free radicals scavenging rate

由圖4可知，在酶解時間在60 min～180 min時，DPPH自由基清除率隨時間的延長而增加，180 min時的清除率為81.15%；而后，隨著酶解時間的延長，清除率下降。在一定范圍內，隨著酶解時間的增加，抗氧化肽產量增加，DPPH自由基清除率增加，但隨著時間進一步增加，部分抗氧化肽被進一步水解，生成不具有抗氧化活性的短肽或氨基酸，DPPH自由基清除率也隨之降低。因此，酶解時間為180 min較合適。

2.2.4 底物濃度對制備抗氧化肽的影響

底物濃度對酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的影響結果見圖5。

圖5 底物濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on DPPH free radicals scavenging rate

由圖5可知，在底物濃度小于3.0%時，DPPH自由基清除率隨底物濃度增加而迅速增加；當底物濃度在3.0%～5.0%時，清除率呈現下降趨勢。在底物濃度較低時，濃度的增加可以加大底物和酶結合的概率，促進反應速率，但隨著底物濃度進一步增加，反應體系的黏度增加，會影響酶和底物間的接觸和有效反應，因此，DPPH自由基清除率隨底物濃度的增加呈現先增加后下降的趨勢。底物濃度為3.0%較合適。

2.3 響應面試驗與結果分析

響應面分析的結果如表2所示。方差分析的結果如表3所示。

表2 響應面試驗設計方案及響應值Table 2 Response surface design and response value

表3 響應面模型方差分析Table 3 ANOVA of response surface model

試驗結果采用Design-Expert 8.0.5軟件的ANOVA程序進行二次回歸分析，DPPH自由基清除率標準回歸方程：Y=82.39600+0.74750A+0.68750B-1.58500C-1.635 00D+2.500 00×10-3AB-2.220 45×10-16AC+5.55112×10-17BC+1.110 22×10-16CD-4.121 33A2-2.241 33B2-4.560 08C2+1.164 92D2。

從表3可以看出，該二次方程模型具有顯著性差異（P＜0.000 1），回歸方程失擬度 P=1.000 0＞0.05，失擬檢驗不顯著，說明該二次回歸模型擬合度良好，試驗誤差?。幌嚓P系數R2為0.9977，說明試測值與預測值之間有高度的相關性[23-24]。校正決定系數R2Adj為0.995 4，說明該模型能解釋99.54%響應值的變化。該模型可信度高，可作為進一步分析的依據。其相關各因素皆為十分顯著（P＜0.01），但交互影響均不顯著。根據所得模型可繪制出相應的響應面分析圖及等高線圖，見圖6。

圖6 各因素交互作用的響應曲面和等高線Fig.6 Response surface plot and contour plot of interaction of various factors

響應曲面坡度和等高線圖的形狀及緊密程度反映了條件變化時對響應值影響的靈敏程度，曲線越彎曲說明研究因素對結果影響越大，等高線呈圓形說明交互作用不顯著。由圖6可以看出，酶濃度（A）、底物濃度（B）、酶解溫度（C）三者兩兩交互作用的響應面坡度變化較陡，等高線為圓形，說明三者對DPPH自由基清除率有顯著影響，但交互作用不顯著。酶解時間（D）與酶濃度（A）、底物濃度（B）、酶解溫度（C）的交互響應面圖及等高線圖可以看出，酶解時間對應的響應面曲線及等高線變化相對陡峭，可以推知酶解時間對DPPH清除率的影響作用大于其他3個因素的影響。

由圖6可知，酶解產物對DPPH清除率隨著酶濃度（A）、底物濃度（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）的增加呈現先增加后下降的趨勢。通過二次多項數學模型解逆矩陣，得出酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝條件為酶濃度1.01%、底物濃度2.08%、酶解溫度54.13℃、酶解時間180.63 min，其預測的最大清除率為85.42%。

考慮實際操作方便，將最佳工藝修正為酶濃度1.0%、底物濃度2.0%、酶解溫度55℃、酶解時間180 min，進行驗證試驗，試驗結果所得抗氧化肽的DPPH清除率為85.16%，與預測值85.42%相近。所以，采用響應面法優化得到的木瓜蛋白酶酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的工藝參數準確可靠，具有實用價值。

2.4 抗氧化活性研究

以優化所得最佳工藝制備抗氧化肽，對其DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原能力、

ABTS+自由基清除率等進行測定并與同濃度VC進行對比，結果見圖7。

圖7 抗氧化肽抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of the antioxidant peptide

由圖7可知，DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原能力、ABTS+自由基清除率都隨著樣品濃度的增加而增加?？寡趸牡牧u基自由基清除率、ABTS+自由基清除率相對較弱，最高分別為71.2%和68.3%，都低于同等濃度的VC相應的抗氧化活性；在濃度為15 mg/mL時，抗氧化肽的DPPH自由基清除率、還原力與同等濃度的VC相應的抗氧化活性相近，表明草菇木瓜蛋白酶水解得到的抗氧化肽具有較好的抗氧化活性。裴云成等[25]采用堿性蛋白酶酶解制備的杏鮑菇柄抗氧化肽的還原力與羥基自由基清除率分別為0.43和47.28%，均低于同等濃度VC的還原力（0.72）和羥基自由基清除率（86.97%），與本試驗研究結果一致。

3 結論

以DPPH自由基清除率作為評價指標，確定酶解草菇蛋白制備抗氧化肽的最佳蛋白酶為木瓜蛋白酶。根據單因素試驗和正交試驗的結果，采用響應面分析方法優化工藝參數，獲得最佳酶解條件為酶濃度1.0%、底物濃度2.0%、酶解溫度55℃、酶解時間180 min，所得的DPPH自由基清除率為85.16%。對最佳工藝所得抗氧化肽DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原能力、ABTS+自由基清除率進行測定，結果表明草菇木瓜蛋白酶水解得到的抗氧化肽具有較好的抗氧化活性。