高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中白藜蘆醇

毋春楠，吳鳳明，蔡鋒隆，范真真，張宇強(qiáng)，毛帥強(qiáng)，于曉雪*，李留安*

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2.天津市廣源畜禽養(yǎng)殖有限公司，天津 301806）

雞蛋是人們餐桌上的“常客”，為人體提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和脂類等營養(yǎng)物質(zhì)。在蛋雞飼糧中添加一定濃度的生物活性物質(zhì)，可增加其在雞蛋中的富集，生產(chǎn)出功能性雞蛋，如富硒雞蛋等。白藜蘆醇（resveratrol，res）是一種非黃酮類多酚物質(zhì)，是植物在受到外界因素刺激時(shí)產(chǎn)生的一種抗毒素[1-2]，廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物和果實(shí)中[3]。白藜蘆醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化及清除自由基等生物調(diào)節(jié)功能，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。在蛋雞飼糧中添加白藜蘆醇，研發(fā)富白藜蘆醇雞蛋，具有較好的市場(chǎng)前景。研究表明，在蛋雞飼糧中添加白藜蘆醇可以改善哈氏單位和蛋白高度等蛋品質(zhì)指標(biāo)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低蛋黃丙二醇含量，延長雞蛋的保質(zhì)期[4]。然而，受測(cè)定動(dòng)物來源樣品中白藜蘆醇含量方法的限制，其在雞蛋中富集情況的研究，未見文獻(xiàn)報(bào)道。

目前，檢測(cè)植物中白藜蘆醇的方法有熒光光度法、紫外分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[5-8]。傳統(tǒng)的熒光光度法和紫外分光光度法操作簡單、成本低，但容易造成結(jié)果誤差大；氣相色譜法操作快速、損失小，但處理過程要求較高，樣品必須經(jīng)過衍生化。高效液相色譜法具有簡便、快速、重現(xiàn)性好、測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，并能夠同時(shí)測(cè)定多種多酚化合物[9]的含量。本試驗(yàn)擬采用高效液相色譜法，對(duì)蛋雞飼糧中添加白藜蘆醇后獲得的試驗(yàn)雞蛋樣品中白藜蘆醇含量進(jìn)行測(cè)定，以期建立一種操作簡便、快速的測(cè)定動(dòng)物樣品中白藜蘆醇含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)雞蛋樣品：金洼農(nóng)業(yè)科技發(fā)展（天津）有限公司蘆花雞養(yǎng)殖基地。隨機(jī)選取114只34周齡的健康蘆花雞，分為3組，每組38只，室內(nèi)平地放養(yǎng)，自由采食和飲水。第一組為普通雞蛋組，飼喂基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)飼糧組成見表1，第2組在基礎(chǔ)日糧中添加1.5 g/kg的白藜蘆醇（1.5 g/kg Res組），第3組在基礎(chǔ)日糧中添加3 g/kg的白藜蘆醇（3 g/kg Res組）。飼喂10 d后，從每組隨機(jī)采集20枚雞蛋，用于檢測(cè)雞蛋中白藜蘆醇的含量。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成Table 1 Composition of basal diet

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent-1260）：安捷倫科技公司；分析天平（FB223）：上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器（KQ-500B）：昆山市超聲儀器有限公司；多用途旋渦混合器（VORTEX-6）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；醫(yī)用離心機(jī)（H1850R）：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DGX-9143 B-2）：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.1.3 主要試劑

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：索萊寶生物科技有限公司；白藜蘆醇原料（純度94%）：陜西楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）：默克股份兩合公司；純凈水：娃哈哈集團(tuán)有限公司；乙酸（冰醋酸）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，甲醇溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，制成濃度為0.05 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃避光封閉保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，該白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為 1、2、4、6、8、10 μg/mL，以上溶液均需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

蛋黃樣品前處理：稱取1g蛋黃樣品于50mL棕色離心管中，加入10mL甲醇，用漩渦混合儀充分振蕩2min，超聲30 min后，5 000 r/min離心10 min，離心后取上清液過0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜進(jìn)樣測(cè)定。

蛋清樣品前處理方法同蛋黃。

1.2.3 高效液相色譜條件的優(yōu)化

色譜柱：C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈，不同流動(dòng)相比例（體積比）=65∶35 和 75∶25；不同流速：0.7 mL/min 和 1 mL/min；不同柱溫：20、25、30 ℃；波長：306 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.4 精密度測(cè)定

按1.2.1方法配制濃度為4 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，參照1.2.3高效液相色譜條件重復(fù)進(jìn)行6次試驗(yàn)，記錄峰面積，確定精密度。

1.2.5 回收率測(cè)定

在同一個(gè)雞蛋樣品中，分別加入濃度為0.4、0.6、0.7μg/mL的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，充分混合，參照1.2.2樣品前處理及1.2.3確定的高效液相色譜條件，各進(jìn)行3次平行測(cè)定，測(cè)定回收率。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（0.05 mg/mL）稀釋為濃度 10、8、6、4、2、1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，參照 1.2.3 高效液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度，縱坐標(biāo)為峰面積。

1.2.7 試驗(yàn)雞蛋中白藜蘆醇含量測(cè)定

試驗(yàn)雞蛋樣品測(cè)定參照1.2.2樣品前處理方法和1.2.3高效液相色譜條件進(jìn)行，樣品中白藜蘆醇的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因子方差分析（one-way ANOVA analysis）Duncan’D檢驗(yàn)進(jìn)行均值間多重比較，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，所有測(cè)定結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜基本條件優(yōu)化

色譜基本條件的優(yōu)化見表2。

表2 色譜基本條件的優(yōu)化Table 2 Optimization of basic chromatographic conditions

由表2可知，試驗(yàn)比較乙酸+水-乙腈流動(dòng)相體系的不同體積比例，結(jié)果表明，乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈=65∶35（體積比）時(shí)，樣品分析時(shí)間短，且色譜圖分離良好；此外，通過考察流動(dòng)相體系的不同流速和柱溫，結(jié)果顯示當(dāng)流速為1 mL/min，柱溫為30℃時(shí)，出峰時(shí)間提前至9.626 min，此時(shí)柱壓穩(wěn)定，目標(biāo)峰與周圍雜峰分離完全，更適用于進(jìn)行批量樣品檢測(cè)。本試驗(yàn)最終確定色譜條件：流動(dòng)相為乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈=65∶35（體積比）、流速 1 mL/min、柱溫 30℃。

2.2 檢出限和定量限

該方法的最低檢出限為0.013 4 μg/mL，定量限為0.044 6 μg/mL。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision test results

由表3可知，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.4%，說明該方法精密度較高。

2.4 回收率試驗(yàn)

樣品加標(biāo)回收率見表4。

由表4可知，白藜蘆醇的平均回收率為86.72%～99.41%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為0.50%～1.05%。

表4 樣品加標(biāo)回收率Table 4 Recovery rate of samples with added standard

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)1.2.1方法制備不同質(zhì)量濃度的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，參照1.2.3確定的高效液相色譜條件測(cè)定分析記錄峰面積，以其質(zhì)量濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of resveratrol

圖1結(jié)果表明：白藜蘆醇在線性范圍1 μg/mL～10 μg/mL內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=72.777x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖如圖2所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard and sample

由圖2可知，白藜蘆醇色譜峰分離情況良好，出峰時(shí)間保留在9 min左右，普通雞蛋樣品中無目標(biāo)峰。

2.7 試驗(yàn)雞蛋中白藜蘆醇含量測(cè)定

按照1.2.2和1.2.3建立的方法對(duì)試驗(yàn)雞蛋中白藜蘆醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 高效液相色譜法檢測(cè)蛋黃中白藜蘆醇含量Fig.3 Determination of resveratrol in egg yolk by HPLC

普通雞蛋組和各試驗(yàn)組蛋清中均未檢測(cè)出白藜蘆醇；普通雞蛋組蛋黃中未檢測(cè)出白藜蘆醇，1.5 g/kg Res組和3 g/kg Res組蛋黃中均檢測(cè)出白藜蘆醇，1.5 g/kg Res組含量為 0.083 μg/g，3 g/kg Res 組含量顯著高于1.5 g/kg Res組（P＜0.05），含量為 0.371 μg/g。

3 討論

3.1 HPLC流動(dòng)相比例和流速對(duì)白藜蘆醇出峰的影響

管錫建等[10]以乙腈-0.1%冰乙酸（20∶80）為流動(dòng)相，流速：1.6 mL/min，柱溫：25℃，測(cè)定葡萄酒中的白藜蘆醇，測(cè)定方法準(zhǔn)確、分析時(shí)間短，但流速較大，流動(dòng)相流速是影響保留時(shí)間的重要因素之一，當(dāng)流速過大時(shí)，容易造成柱壓不穩(wěn)定，出峰時(shí)間提前，與雜峰分離不完全；俸靈林等[11]以乙腈-水（20∶80）為流動(dòng)相，流速：1 mL/min，柱溫：30℃，測(cè)定虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，分離度好，操作簡便，但出峰時(shí)間在25 min左右，不適用于進(jìn)行批量樣品檢測(cè)；GB/T 24903—2010《糧油檢驗(yàn)花生中白藜蘆醇的測(cè)定》[12]以乙腈+水+乙酸（250 mL+750 mL+0.9 mL）為流動(dòng)相，流速0.7 mL/min，柱溫：室溫，對(duì)花生中的白藜蘆醇進(jìn)行測(cè)定，目標(biāo)物白藜蘆醇出峰時(shí)間早，與雜峰分離完全。本試驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相比例、流速及柱溫進(jìn)行了優(yōu)化，確定了流動(dòng)相：乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈=65∶35（體積比）、流速：1 mL/min、柱溫：30℃的色譜條件，以該方法測(cè)定試驗(yàn)雞蛋中的白藜蘆醇，出峰時(shí)間早，峰型好，與雜峰分離完全。

3.2 樣品中白藜蘆醇的含量測(cè)定

目前國內(nèi)外關(guān)于白藜蘆醇含量測(cè)定的研究多集中于植物提取、醫(yī)藥護(hù)膚品等方面，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品中白藜蘆醇含量的測(cè)定研究未見報(bào)道。曹庸等[13]利用HPLC對(duì)虎杖中的白藜蘆醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明虎杖鮮根莖中的白藜蘆醇含量最高，可達(dá)0.157%；向陽等[14]建立HPLC測(cè)定不同品種葡萄皮和葡萄籽中白藜蘆醇含量的方法，結(jié)果表明葡萄皮中的白藜蘆醇含量均高于葡萄籽，且同一產(chǎn)地不同品種葡萄中的白藜蘆醇含量也不相同，為保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在樣品處理過程中應(yīng)避免白藜蘆醇成分的損耗和降解；史先敏等[15]等利用反向高效液相色譜法（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）建立護(hù)膚品中白藜蘆醇含量的測(cè)定方法，采用甲醇作為提取試劑，處理成本低、測(cè)定方法簡便，可滿足化妝品中白藜蘆醇含量的檢測(cè)，便于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。本試驗(yàn)通過在蛋雞基礎(chǔ)飼糧中添加1.5、3 g/kg的白藜蘆醇來獲得試驗(yàn)雞蛋樣品，結(jié)合白藜蘆醇易溶于有機(jī)溶劑的特性，采用甲醇對(duì)試驗(yàn)雞蛋進(jìn)行預(yù)處理，并優(yōu)化建立HPLC檢測(cè)試驗(yàn)雞蛋中白藜蘆醇含量的方法，操作簡單、重現(xiàn)性好，為白藜蘆醇在動(dòng)物源性食品中富集的含量測(cè)定提供方法參考。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)優(yōu)化建立了一種高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中白藜蘆醇的分析方法，在色譜條件為流動(dòng)相：乙酸+水（0.9 mL+750 mL）∶乙腈=65∶35（體積比）、流速：1 mL/min、柱溫：30℃時(shí)，可在飼糧添加白藜蘆醇獲得的試驗(yàn)雞蛋蛋黃中檢測(cè)出白藜蘆醇。該方法操作簡單、目標(biāo)物白藜蘆醇出峰時(shí)間早，與雜峰分離完全，重現(xiàn)性良好。