基于ITS基因的三七PCR分子鑒定方法

夏暉，張芹，吳弘，季超，陳怡，原楚妍，孫星宇，鄭文杰*

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201）

三七[Panax notogingseng（Burk.）F.H.Chen]，五加科植物，又名田三七、山漆、田七等，具有止血散瘀、降血糖等作用[1-5]。此前，依據我國原衛生部《關于進一步規范保健食品原料管理的通知》，三七屬于可用于保健食品的名單。近年來，三七飲片及其他制品越來越受消費者歡迎，一些不法商販在經濟利益的驅使下，在制品中摻雜、摻假，這極大地損害消費者的利益和健康。目前對于三七尚且沒有現存的標準可用于向市場監管提供依據[6]。市面上各種三七制品存在一定的實物與標簽不符的現象，已報道的可作為三七摻假材料主要包括水田七、菊三七和姜黃等[7-8]，因此建立三七真偽鑒定的方法和標準十分必要。目前關于三七及其制品摻假的檢測方法主要包括顯微鏡觀察法[9-12]、紅外光譜方法[13-14]、色譜分析法[14-19]和分子生物學方法[20-23]。根據已有的文獻報道，劉潤花等[18]、王晶等[19]成功使用薄層色譜、紫外光譜掃描等測定三七有效成分的含量評價三七產品；崔秀明等[24]建立三七及其偽品的指紋圖譜，以達到區分的目的。隨著近年三七的需求日益上升，開發快速高效的檢測方法具有重要意義。

本研究通過比對三七及多種近緣植物的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列，分析種內保守、種間特異的序列，并以此設計特異性引物，旨在建立三七及其制品的快速聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，為三七及其制品的摻假檢測提供更多技術支撐。這種基于ITS序列作為DNA條形碼的鑒別方法操作簡便、靈敏度高，為有效監控三七產品的質量，進行證偽鑒定提供一種可行方案。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

三七樣品（采自云南石林西街口、大黑山、硯山彎沖、丘北小白山村、尋甸、戈的、壩子、大塘子）；三七近緣物種（珠子參、人參、西洋參、竹節參）；易混植物（姜黃、血三七、莪術、白芨、菊三七）；三七花翠竹茶、三七花粉、姜黃三七膠囊、三七葉粉、三七片、三七根等13種食品保健品：市售。

磁珠法植物基因組提取試劑盒、天根DL2000 DNA Marker、DL500 DNA Marker、Emerald MAX HS PCR Master Mix：寶日醫生物技術（北京）有限公司；Gold View：天津為科生物技術有限公司；PCR引物合成：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 DNA提取和檢測

磁珠法主要參照磁珠法植物基因組提取試劑盒（天根）提取，選擇GPS plus溶液；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法及十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法參照文獻[25]。提取全基因組DNA后，使用核酸蛋白測定儀測定提取DNA濃度及純度[26]。

1.3 引物設計和PCR擴增

選擇三七ITS通用引物[27]（正向引物：5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3'，反向引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR擴增。對不同地點的三七進行擴增，經Sanger測序后在GenBank中檢索比對，確認測序結果后通過MEGA7進行序列比對，找出不同地點三七堿基存在差異之處，即為種內可變異位點。對三七等樣品進行擴增，經測序后在GenBank中檢索比對，確認測序結果后通過MEGA7進行同源性比對，找到特異位點經Primer Express 5.0設計特異性引物。

通用引物擴增PCR條件：94℃預變性5 min；94℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃復性 60 s，共35個循環；最后72℃延伸10 min。特異性引物擴增PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性10 s，59℃退火30 s，72℃復性10 s，共32個循環；最后72℃延伸10 min。

取5 μL PCR擴增產物直接進行瓊脂糖凝膠電泳，將PCR擴增后的產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.4 特異性試驗

選取8個地區的三七以及三七的近緣種、易混種（珠子參、西洋參、人參、竹節參、菊三七、莪術、白芨、姜黃共8種）。CTAB法提取DNA后，以此為模版采用建立的PCR方法與三七進行擴增，驗證該方法的特異性。

1.5 靈敏度試驗

將三七及西洋參、人參、白芨的DNA稀釋至20 ng/μL，然后將三七DNA分別與西洋參、人參、白芨的DNA混合，制成含三七DNA 10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%（體積分數）的混合DNA樣。以混合DNA樣為模版，采用建立的PCR方法進行擴增，以確定不同樣品的檢出限。

1.6 市售樣品驗證

以三七根、三七超細粉、三七壓片制品等13種各類別三七產品為樣品，提取核酸，應用已建立的方法進行檢測并采用植物源性樣品通用引物對其驗證。以18S rRNA基因的通用引物作為內參進行擴增（正向引物：5'-GATGCGCTCCTGTCCTTAAC-3'，反向引物：5'-CATCCTTGGCAAATGCTTTC-3'），PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃復性30 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產物直接進行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果與分析

2.1 DNA提取方法比較

本文采用CTAB法、改良SDS法、磁珠法3種不同的DNA提取方式處理三七根（鮮組織）、三七葉（鮮組織）、三七根（干粉）、血三七根（干粉）。將提取的DNA利用超微量分光光度計進行測定，得到其濃度與純度數值見表1，經瓊脂糖凝膠電泳得到不同樣品的DNA電泳圖見圖1。為了進一步比較其提取質量，本試驗以提取的DNA為模板，利用ITS通用引物進行PCR反應，將產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。

圖1 3種提取方法所得樣品全基因組DNA的電泳結果Fig.1 Electrophoretic results of genomic DNA obtained by three extraction methods

表1 3種方法提取的DNA濃度與純度結果Table 1 DNA concentration and purity results extracted by three methods

3種DNA提取方法在處理三七樣品中各有優缺點。磁珠法方便簡單快速，三七鮮組織的提取效果較好。CTAB法耗時大約2 h～3 h，但產物帶有顏色，且會加深至褐色，推測為植物根部次生代謝產物如酚類等物質未被除凈。電泳時，血三七根泳道出現深色陰影，為有色物質條帶，該類物質雖不影響PCR擴增反應，但不利于植物基因組的分析研究。SDS法則利用K+與SDS結合形成PDS吸附多糖蛋白，且提取過程中經歷兩次沉淀，相比CTAB法，沉淀時顏色較淺，但基因組電泳未檢測到條帶。由圖2可知，這3種方法提取的DNA擴增后均能產生質量較好的條帶。因此，針對不同樣品，比較這3種方法提取質量，結果表明：新鮮組織提取效果均比較理想；干粉提取后直接電泳，檢測不到條帶，推測可能由于長時間保存導致DNA降解嚴重。在實際情況中，市場上的三七產品大多為粉末狀且保存時間較長，因此綜合PCR結果與DNA的提取質量，初步認為在三七的分子鑒定過程中CTAB法提取的DNA不僅擴增后條帶明亮，并且由于提取量大，得率較高比較適于研究使用。

圖2 利用通用引物擴增不同提取方法所得基因組DNA的電泳結果Fig.2 Electrophoretic results of genomic DNA amplified by universal primers

2.2 三七特異性鑒別引物設計

為進一步了解三七種內的差異情況，利用通用引物對目前從8個點采集來的三七樣品進行擴增，將得到的ITS序列送公司完成測序。針對結果進行深入分析，發現不同樣品ITS的變異位點見表2。

表2 三七種內ITS序列變異位點Table 2 ITS sequence variation sites in Panax notoginseng species

由表2可知，三七ITS序列種內僅存在4個變異位點，適合進行特異性引物的設計。對三七及其常見偽品的ITS區序列進行比對分析，從而設計三七的特異性引物。利用CTAB方法提取了三七近緣及相似植物的基因組DNA。隨后以植物的基因組DNA為模板，利用ITS通用引物進行擴增，得到結果后進行序列分析。4種植物樣品經CTAB法DNA濃度與純度結果見表3。CTAB方法在這幾種常見植物的DNA提取中表現出較高的效率。將4種植物（人參、西洋參、血三七、珠子參）以及三七的ITS序列進行測序分析，見圖3。

表3 4種植物樣品經CTAB法DNA濃度與純度結果Table 3 DNA concentration and purity results of 4 plant samples by CTAB method

圖3 ITS序列通用引物擴增序列比對Fig.3 Alignment of ITS sequence amplification results

利用序列間的差異，設計出三七的特異性引物（正向引物：5'-CGACATGAGAAGAGGGCTCTTA-3'，反向引物：5'-ATCATTCCCTCGCGGGAGTC-3'）。為進一步提高特異性，在上游引物引入錯配位點。對引物進行篩選，并對PCR反應條件進行優化，建立三七的DNA檢測方法。

2.3 特異性試驗結果

8個地區三七樣品特異性試驗結果見圖4，三七與8個陰性樣品特異性試驗結果見圖5。

圖4 8個地區三七樣品特異性試驗結果Fig.4 The specificity experimental results of Panax notoginseng from eight regions

為驗證引物對三七的特異性，將三七以及其近緣種、易混植物（珠子參、西洋參、人參、竹節參、姜黃、菊三七、莪術、白芨）的DNA作為模板，利用本研究設計的特異性引物進行PCR擴增，三七具有特異性擴增條帶，大小在100 bp～150 bp之間，符合預期；由圖5可知，其余8種中藥均沒有條帶出現。因此，通過特異性試驗發現，本試驗設計的引物針對三七及其近緣種、易混植物具有較好的特異性，可以用于三七的鑒定試驗。

圖5 三七與8個陰性樣品特異性試驗結果Fig.5 The specificity experimental results of Panax notoginseng and eight negative samples

8個不同采樣地三七特異性引物擴增結果序列比對見圖6。

圖6 8個不同采樣地三七特異性引物擴增結果序列比對Fig.6 Amplified sequence alignment of Panax notoginseng from eight different places

將三七PCR產物送測序公司測序，分析測序結果，發現擴增序列在種內擴增穩定，準確度高，進一步證明了該引物特異性強、準確度高。

2.4 靈敏度試驗

三七與西洋參、人參、白芨按照一定比例混合特異引物擴增，結果見圖7。

圖7 三七與西洋參、人參、白芨按照一定比例混合特異引物擴增結果Fig.7 Amplification results of Panax notoginseng mixed with Panax quinquefolium L.，Panax ginseng C.A.Meyer，Bletilla striata，in a certain proportion

將提取到的三七DNA樣品與西洋參、人參、白芨DNA樣品混合，制成一定比例梯度濃度的DNA樣品（濃度梯度為10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%）。以不同濃度的三七混合品為模版，利用之前確定的特異性引物進行擴增鑒別。結果表明，西洋參和白芨在0.5%的濃度下，擴增不出條帶，PCR結果呈現為陰性，而人參則在0.05%的濃度下條帶不明顯，空白對照無擴增。因此該結果說明，西洋參、白芨與三七的混合品DNA濃度均能達到0.5%檢出限水平，而人參與三七的混合品則可以達到0.05%的檢出限水平。本研究初步建立的基于ITS基因的三七PCR鑒別體系能夠穩定、準確地對三七及其偽品進行分子水平的鑒別。

2.5 市售樣品檢測

市售樣品18S rRNA通用引物擴增結果見圖8，市售樣品特異引物擴增結果見圖9。

圖8 市售樣品18S rRNA通用引物擴增結果Fig.8 Amplification of commercially available samples using 18S rRNA

圖9 市售樣品特異引物擴增結果Fig.9 Amplification of commercially available samples using specific primer

應用本文所建立的PCR檢測方法對市售的13份樣品進行三七源性成分檢測。提取市售三七樣品的DNA，以18S rRNA通用引物作為內參進行擴增，13種樣品均能擴增出特定條帶，說明DNA提取情況良好，以特異性引物繼續擴增試驗，結果發現其中10份樣品檢出三七源性成分。由此說明所建立的PCR方法能夠快速檢測市場三七源性成分的食品和保健品，未檢出的市售樣品可能存在質量摻假問題。

3 結論

本研究建立的檢測三七及其制品中三七源性成分的PCR方法特異性強，通過觀察多次試驗的數據，證實該法重現性良好，靈敏度較高，可達到0.5%的檢測限，該方法的檢出限基本能夠滿足市場監測的要求。試驗證明：基于三七ITS序列的PCR檢測是一種非常有效的鑒別和檢測三七的方法，為三七制品中三七源性成分檢測方法的標準化提供科學依據。并且基于此方法還可以建立熒光定量PCR檢測方法以滿足更加豐富的檢測需求，可以達到更低的檢出限、并可定量分析三七制品的摻假比例。