核糖核酸5′端NAD+帽子修飾研究進展

董海嬌 楊曉玉 莫蓓莘 陳雪梅 崔潔

（1. 深圳大學生命與海洋科學學院，深圳 518037；2. 深圳大學光電工程學院 光電子器件與系統（教育部/廣東省）重點實驗室，深圳 518060；3. 山東農業大學園藝科學與工程學院，泰安 271018；4. 美國加利福尼亞大學河濱分校整合基因組學研究中心/植物科學系，美國加州河濱 92521）

核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）分子同時具有信息分子和調控分子的雙重身份，在生命活動的各個方面發揮著重要作用。它種類繁多，主要包括經典的信使RNA（messenger RNA，mRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和轉運RNA（transport RNA，tRNA），以及近年來陸續被發現和報道的、具有基因表達調控作用的微小RNA（microRNA，miRNA）和具有免疫和防御功能的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）等［1-2］。隨著技術的更新和研究的深入，RNA在不同生物學過程中的功能和作用機制逐漸被揭示。

RNA功能的發揮主要由其自身序列和結構特征所決定，同時基于共價化學修飾的表觀轉錄組（epitranscriptome）調控也發揮了重要的作用［3］。目前，在RNA分子上已鑒定到超過170種化學修飾，它們發生在長鏈分子內部或者兩端，且多見于tRNA和rRNA上［4］。mRNA分子內部常見的堿基修飾有N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）和假尿苷（pseudouridine，Ψ）化等，它們在mRNA的穩定性、內含子剪切、輸出、翻譯等生物學過程中發揮著重要的調控作用［5］。其中，mRNA的m6A修飾是近年的研究熱點，該過程的異常會導致動植物發育異常和疾病的出現，如胚胎發育遲緩和腫瘤等［6-7］。

7-甲基鳥嘌呤（7-methylguanosine，m7G）是真核生物mRNA 5′端特有的、經典的加帽修飾，參與調控mRNA的穩定性、加工、運輸和翻譯等生物學過程，具有重要的生物學意義［8-9］。不同于真核生物，傳統觀點認為原核生物mRNA 5′端以三磷酸RNA（pppRNA）為主，沒有類似m7G的帽子結構［10］。但是2009年，研究人員利用液相色譜-質譜聯用儀（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）對細菌RNA的5′端進行分析，鑒定到兩種新的共價修飾，即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和輔酶A衍生物（dephosphocoenzyme A，DP-CoA），并且NAD+帽子修飾的RNA（NAD-RNA）占比更高［11-12］。隨后，人們陸續在酵母、小鼠、人源細胞、擬南芥等真核生物中也發現了NAD-RNA［13-14］，暗 示RNA的NAD+加 帽 是 一種非常保守的修飾機制。近年來，研究人員整合酶處理捕獲和高通量測序技術（NAD captureSeq），實現了全轉錄組水平的NAD-RNA鑒定［15-16］，為隨后NAD-RNA生物學功能及NAD+修飾代謝通路的研究奠定基礎。

NAD+又稱輔酶Ⅰ，是生物體內多種脫氫酶的輔酶，可把代謝過程中由脫氫酶催化產生的氫離子傳遞給黃素蛋白，從而將三羧酸循環和呼吸鏈反應串聯起來［17-18］。而NAD+作為一種全新的RNA 5′端修飾結構，從最初發現至今僅有十幾年的時間，特別是在真核生物中，NAD-RNA的鑒定和研究剛剛起步。本文聚焦于NAD-RNA，從其發現、檢測技術的發展、生物學功能及其調控機制等方面對目前該領域取得的最新進展進行總結，并對今后的研究做出展望。

1 NAD-RNA的發現及其檢測技術的發展

NAD-RNA最早發現于大腸桿菌（Escherichia coli）和委內瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）體內。2009年，研究人員利用分子排阻色譜（size-exclusion chromatography）分離E. coli和S. venezuelae的大分子RNA片段，然后以核酸酶P1將其消化為小分子片段，通過高分辨率LC-MS對這些小分子片段進行分析，首次檢測到了位于RNA 5′端的NAD+帽子修飾［11］。Grudzien-Nogalska等［19］在此基礎上提出通過兩步法來檢測NAD-RNA的含量，即“NAD-capQ”（NAD cap detection and quantitation）法，主要包括NAD-RNA的核酸酶P1處理和游離的NAD+含量的比色法檢測。目前，NAD-capQ已成功應用于大腸桿菌、酵母、人源細胞HEK293T和擬南芥中NADRNA的定量檢測［14，19］。最近，Wang等［13］結合offline HPLC（high performance liquid chromatography，高效液相色譜）和LC-MS/MS開發了可富集定量各種RNA帽子結構的CapQuant檢測法，并在登革熱病毒、大腸桿菌、酵母、小鼠肝臟和腎臟以及人源B淋巴細胞的mRNA中鑒定到包括m7G、NAD+在內的26種帽子修飾，也表明NAD+同m7G一樣存在于mRNA的5′端。

NAD+及其代謝衍生物可參與生物體內多種基礎的生理活動，在調控細胞氧化還原穩態、蛋白翻譯后修飾以及信號轉導等過程中發揮著重要作用，其含量異常可導致多種疾病的發生［20-21］。NADRNA是否參與上述過程，或者與其它未知的代謝和調控途徑有關呢？為了解答上述問題，研究人員開發了NAD captureSeq，利用腺苷二磷酸核糖環化酶（adenosine diphosphate-ribosylcyclase，ADPRC）在炔醇存在條件下催化RNA 5′端NAD+發生轉糖基化反應生成炔烴RNA（alkyne-RNA），隨后通過銅催化的炔疊氮化物環加成（a copper-catalysed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC）反應將alkyne-RNA轉化為生物素標記的RNA（biotin-RNA）（圖1-A），最后借助鏈霉親和素磁珠分離biotin-RNA并進行高通量測序，實現了在全基因組水平上對E. coli體內NADRNA的分析和鑒定［15］，結果表明，E. coli中NADRNA大多為特異的調控類小RNA（small RNA，sRNA）和mRNA［15］。隨后，研究人員利用NAD captureSeq先后在酵母、人源細胞、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和擬南芥中鑒定NAD+加帽修飾的RNA［14，22-24］；與E. coli的研究結果類似，這些物種中的NAD-RNA主要是mRNA，另有少量的非編碼RNA，表明NAD+是一種普遍存在的RNA修飾類型，且與m7G一樣主要修飾mRNA，但可轉錄生成NAD-RNA的基因數目要少于轉錄生成m7G-RNA的基因數目。對大腸桿菌、酵母、小鼠和擬南芥中NAD-RNA生成基因的GO（gene ontology）分析結果顯示，這些基因編碼的蛋白主要涉及信號轉導、轉錄相關過程、蛋白翻譯及非生物脅迫響應如冷、熱、旱、鹽、ABA、營養缺失等［14-15，24-29］。

圖1 NAD-RNA的CuAAC（A）和SPAAC（B）反應示意圖Fig. 1 Schematic diagram of CuAAC（A）and SPAAC（B）reactions of NAD-RNA

盡管NAD captureSeq為人們鑒定NAD-RNA提供了有力的技術保障，但其仍存在一些缺陷。首先，在捕獲NAD-RNA的CuAAC反應中，二價銅離子（Cu2+）的存在會導致一定程度的RNA降解，從而引起鏈霉親和素磁珠富集的RNA片段呈現一定的5′端偏好，這不利于對NAD-RNA全長轉錄本序列信息的了解以及其轉錄水平的計算；此外，該方法存在一定程度的假陽性，近期有研究表明CuAAC反應對真核生物m7G-RNA亦存在微弱的轉化能力，導致捕獲到的RNA分子中存在一定量的m7G-RNA。為了克服上述問題，Hu等［26］在2021年提出了SPAAC-NAD-seq，用以鑒定擬南芥中的NAD-RNA；該方法首先利用anti-m7G抗體特異去除擬南芥mRNA中的m7G-RNA，然后通過不依賴Cu2+的應變促進的炔疊氮化物環加成（strainpromoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC）反 應體系（圖1-B），捕獲NAD-RNA并進行二代測序分析。與NAD caputureSeq相比，SPAAC-NAD-seq避免了m7G-RNA和Cu2+的干擾，因此大大提高了NAD-RNA鑒定的準確性和靈敏度。除此以外，Zhang等［28-31］在2019年和2021年先后利用CuAAC和SPAAC反應處理擬南芥和大腸桿菌RNA樣本，然后在NAD-RNA的5′端連接一段合成的RNA標簽（tagRNA）作為接頭（adaptor），進一步富集含接頭的NAD-RNA并通過Oxford Nanopore sequencing三代測序完成對NAD-RNA轉錄本信息的鑒定。相比NAD caputureSeq和SPAAC-NAD-seq，該策略省去了傳統illumina測序中的RNA片段化、cDNA合成、PCR擴增和片段篩選步驟，進一步簡化了NADRNA測序流程。以上全基因組水平的測序研究結果均表明，NAD+加帽修飾主要發生于部分編碼蛋白的mRNA和部分具有特異調控功能的sRNA，其中真核生物中NAD+-mRNA主要來源于核基因，少數來源于線粒體基因，并為研究其具體的生物學功能奠定基礎。

2 NAD+帽子對RNA轉錄后調控的影響

已有研究結果表明，真核生物中NAD+修飾的基因大多亦可被m7G加帽［14，23］。NAD+帽子是否和m7G一樣，能夠保護RNA不被降解、招募相關蛋白參與RNA內含子剪切、poly（A）加尾、出核和完成蛋白翻譯等生物學過程呢？大腸桿菌中的研究結果表明，NAD-RNA可以抵抗RNA焦磷酸水解酶（RNA-pyrophosphohydrolase，RppH）對其5′端的加工，進而避免被核糖核酸酶E（ribonuclease E，RNase E）降解［15］；此外，原核生物B.subtilis的NAD+加帽修飾也具有穩定RNA的作用，可防止RNase J1介導的5′端到3′端降解的發生［22］。不同于上述原核生物，真核生物中廣泛存在一類具有脫帽功能的酶DXO蛋白，可以去除哺乳動物和擬南芥體內RNA的NAD+帽子，產生不穩定的5′單磷酸RNA（pRNA），并進一步催化將其降解，最終影響體內NAD-RNA的水平［23，27］，這表明原核和真核生物中RNA的NAD+加帽修飾可能具有不同的生物學意義。

高通量測序如RNA-seq、翻譯組測序（ribosome profiling）等是研究RNA修飾的轉錄后調控等生物學過程的重要手段［7，32］。目前，部分研究小組已經開展了人源細胞HEK293T和擬南芥NAD+加帽修飾對mRNA加工和翻譯影響的初步研究工作，結果顯示NAD-RNA可順利完成內含子剪切和poly（A）加尾過程［14，23，26，29］；同時，進一步檢測到擬南芥的內源NAD-RNA富集于多聚核糖體，暗示了NADRNA可能具有蛋白編碼的功能［14］。但是也有不同的研究結果被報道。在2017年，有研究人員將NAD+加帽和poly（A）加尾修飾的熒光素酶基因mRNA導入人源細胞HEK293T中，檢測熒光素酶含量，發現與對照并無顯著差異，推測外源NAD+-mRNA在HEK293T細胞不具備蛋白翻譯的功能［23，33］。因此，關于體內NAD-RNA是否具有蛋白編碼的能力、是否可以向胞質運輸以及原核生物和真核生物NADRNA轉錄后調控的異同等仍有待深入研究。

3 RNA的NAD+加帽和脫帽分子機制初探

真核生物中基因轉錄成NAD -RNA的含量約占相應轉錄本總含量的1%-6%［14，23，24，33］，且體內NAD-RNA總含量也遠低于m7G-RNA的占比［13］。NAD+加帽和脫帽反應的效率直接決定NAD-RNA的含量。不同于m7G-RNA的轉錄起始后加帽［34-37］，RNA的NAD+加帽反應可能存在兩種模式，即轉錄起始和轉錄后加帽［33］。（1）轉錄起始加帽：在體外條件下或細菌體內，NAD+可作為一種稀有的起始核苷酸（non-canonical initiating nucleotide，NCIN）在細菌RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）或真核生物RNAP II作用下，替代ATP作為首位堿基轉錄形成NAD-RNA［22，38-39］；相比細胞核RNAP，真核生物酵母和人的線粒體RNAP（mitochondrial RNAP，mtRNAP）可更加高效地利用NAD+合成NAD-RNA。此外，NAD+加帽的效率也受轉錄起始位點（transcription start site，TSS）序列（+1A）、TSS上游序列（-1R）以及細胞內的NAD+含量等因素影響［38，40］。利用CapZyme-Seq技術，研究人員分析了E. coli中約16 000個NAD-RNA基因啟動子序列，發現決定NAD+加帽的啟動子的特征序列為H-3R-2R-1A+1S+2W+3W+4，其 中A+1為TSS［41］。（2）轉錄后加帽：哺乳動物snoRNA（small nucleolar RNA）和 scaRNA（small cajal body RNA）是大多來源于基因內含子的非編碼小RNA［42-44］，Jiao等［23］研究發現被核酸外切酶加工過的sno / scaRNA 5′端可被NAD+修飾，暗示哺乳動物體內可能存在轉錄起始后的加帽反應。

除了加帽效率，生物體內脫帽反應也是影響NAD-RNA含量的重要因素。DXO蛋白家族是一類可以清除真核生物體內異常帽子修飾RNA的酶［45］，如前所述，也具有清除NAD-RNA的功能。DXO的NAD+脫帽活性最早在哺乳動物細胞中被檢測到，可去除體內部分NAD-RNA中的NAD+帽子并進一步催化降解pRNA［23］，模式植物擬南芥的DXO1蛋白也具有相似的功能［27］；進一步研究發現，當擬南芥DXO1功能缺失時，體內的NAD-RNA可被加工成小RNA［27］，暗示NAD-RNA在特定條件下可能通過小RNA介導的表觀調控機制發揮作用，因此增加了NAD-RNA調控網絡的復雜性。Nudix（nucleoside diphosphate linked to another moiety X）是另一類只具有脫帽活性的水解酶蛋白家族，E. coli的Nudix家族成員RppH可以催化三磷酸RNA（pppRNA）生成pRNA，進而由RNase E從5′端起始將其降解［10，46］；哺乳動物Nudix家族成員Dcp2、Nudt3和Nudt16可催化體內m7G-RNA的脫帽反應，而Nudt2、Nudt12、Nudt15、Nudt17和Nudt19則 具有體外去m7G帽子的活性［47］。最近的研究結果表明，Nudix也參與了NAD-RNA的脫帽過程，但不同于DXO蛋白，它在NAD+的煙酰胺和腺嘌呤之間發生酶解反應，并依賴于核糖核酸酶進一步降解脫帽的pRNA，例如，NudC和RppH可分別催化E. coli和B. subtilis體內NAD-RNA的脫帽反應，生成NMN（nicotinamide mononucleotide）和pRNA［15，22］；小鼠Nudt12靶向與DXO不同的NAD-RNA，主要參與編碼線粒體蛋白的核基因mRNA的NAD+脫帽反應［25］；對哺乳動物22個Nudix成員的脫帽活性進行研究，發現除上述Nudt12外，Nudt16也具有去除RNA 5′端NAD+帽子的功能［48］。此外，真核生物糖基水解酶CD38可在體外反應條件下將NAD-RNA分解為成ADP-RNA和煙酰胺，暗示其可能是一類新的NADRNA脫帽酶［49］。然而，目前關于生物體內NADRNA加帽和脫帽等代謝過程以及調控途徑的研究仍處于起步階段，有待于在今后的研究中進一步挖掘解析。

4 NAD-RNA與生長發育和環境脅迫

生物體內NAD-RNA的豐度和種類與生長發育階段和環境因素密切相關。研究發現，E. coli指數和穩定生長期NAD+加帽修飾的RNA有較大差異，除了兩個時期共有的79個基因外，另有50個指數生長期特異表達的NAD-RNA基因以及150個穩定生長期特異表達的NAD-RNA基因［28］；擬南芥幼苗和花中NAD-RNA的豐度以及可轉錄生成NAD-RNA的基因亦存在一定的差異［14］，這些結果暗示基因的NAD+加帽修飾可能具有一定的時空表達特異性。與YEPD（yeast extract peptone dextrose）培養基相比，生長在合成培養基上的酵母體內NAD+-mRNA基因種類更多［24］；將人源HEK293T和包皮成纖維細胞進行熱激（42℃）處理或置于葡萄糖缺失的培養基中培養，NAD-RNA的含量均顯著提高［25］；擬南芥幼苗NAD-RNA可響應脫落酸（abscisic acid，ABA）處理，并且多數響應ABA的NAD-RNA的脫帽過程不依賴DXO1［27］；對可轉錄成NAD-RNA的基因進行GO分析，它們部分富集于非生物脅迫相關的路徑［14，15，24，26-29］，以上結果表明NAD-RNA的合成與代謝過程與外界環境因素也密切相關，這可能與NAD+的輔酶特性有關。

5 總結與展望

借助于LC-MS和NAD captureSeq等技術，人們發現了RNA 5′端的NAD+加帽這一新的修飾類型。NAD+作為一種輔酶，在轉錄過程中可替代ATP作為起始堿基、通過RNAP/RNAP II的催化生成NADRNA，并進一步完成內含子剪切、poly（A）加尾等轉錄后加工過程。不同于經典的真核生物m7G帽子，NAD+加帽修飾在原核和真核生物RNA上均可檢測到，并且該修飾對RNA在原核和真核生物中穩定性的影響存在差異；同時，真核生物中NAD-RNA的占比遠低于m7G-RNA。基于此，我們推測NADRNA的起源進化可能要早于m7G-RNA，早期在原核生物中NAD+加帽具有保護RNA不被降解、維持其穩定性的作用；但隨著生物的進化，NAD-RNA可能發生了功能分化，被真核生物識別為異常RNA，進而被DXO等脫帽酶脫帽并進一步降解，與此同時真核生物RNA被特有的m7G帽子所保護而不被降解并完成后續一系列的轉錄、轉錄后和翻譯等過程，逐漸替代NAD-RNA占主導地位。

后續可從以下幾個方面進行研究，來驗證上述猜測：（1）開展關于NAD-RNA和m7G-RNA代謝通路重要基因的進化分析；（2）鑒定與NAD+加帽、脫帽、識別等過程相關的基因，并通過這些基因的功能研究解析NAD-RNA的變化對生物體的影響；（3）NAD-mRNA能否完成正常的蛋白翻譯過程，與m7G-RNA一樣以蛋白形式發揮功能？或者直接以RNA形式作為調控因子發揮功能？（4）NAD+修飾的非編碼RNA是否具有調控功能？

除了NAD-RNA，近年來在生物體內還檢測到了許多其他類型加帽修飾的RNA，比如dpCoA-RNA、FAD-RNA、UDP-Glc-RNA和UDP-GlcNAc-RNA等，它們在體內的含量也遠低于m7G-RNA［13］。然而，這些RNA序列信息以及與NAD-RNA、m7G-RNA是否存在著關聯仍然未知。相信隨著后續相關分析技術的突破，將會促進該領域相關研究工作的開展，進一步拓展和豐富RNA生物學基礎理論知識。