茶樹原位轉化方法的建立

周承哲 常笑君 朱晨 程春振 陳裕坤 賴鐘雄林玉玲 郭玉瓊

（1. 福建農林大學園藝學院，福州 350002；2. 福建農林大學茶產業研究院/茶學福建省高校重點實驗室，福州 350002；3. 福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福州 350002）

茶樹（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze）系山茶科山茶屬多年生常綠木本植物，其葉片常用于加工成世界上銷量最大的無酒精飲料——茶［1］。茶因富含茶多酚、茶氨酸及咖啡堿等多種特征性次生代謝物，具有卓越的保健功效及優異的風味品質［2］。在茶樹基礎生物學研究中，特征次生代謝產物生物合成相關基因的調控機制是研究熱點［3-5］。為精確研究與茶樹優良性狀相關基因的功能，提升突破性茶樹新品種的選育效率，亟需建立一套高效、穩定的茶樹遺傳轉化體系。

迄今，茶樹基因功能驗證大多依賴擬南芥和煙草等模式植物的異源表達系統［6-8］。然而，生物合成網絡的復雜性和多樣性，往往使得異源表達系統不適用于茶樹特征基因功能鑒定。而茶樹基因功能基礎研究的缺失，也制約了生產上急需的突破性新品種定向選育。此外茶樹具有童期長，優良性狀難以早期鑒定等特點，導致依賴于系統選種和雜交育種的傳統茶樹育種手段效率低下［9］。2001年，Mondal等［10］首次建立了一種以茶樹子葉為外植體誘導體胚發生的遺傳轉化體系，利用農桿菌介導法獲得了轉基因茶樹。此后，陸續有基于組織培養成功在茶樹本物種上實現轉基因的案例［11-12］。

由于茶樹體胚富含多酚類物質，且體胚的誘導、成熟和萌發時間較長，使得茶樹組織培養過程中存在嚴重的褐化現象，且可重復性差。因此，現階段依賴于組織培養的茶樹轉基因體系普遍實施周期長、轉化率低，難以獲得轉基因植株［13-14］。1987年，Feldmann和Marks建立了一種直接利用農桿菌菌液浸泡萌發的擬南芥種子獲得轉基因植株的原位轉化方法［15］。該方法具有不依賴于組織培養、操作簡單、試驗周期短及轉化效率高等特點，已成功在 棉 花（Gossypium hirsutum）［16］、白 菜（Brassica campestris）［17］、番 茄（Solanum lycopersicum）［18］、沙 田 柚（Citrus maxima）［19］、伏 令 夏 橙（Citrus sinensis）［20］及龍眼（Dimocarpus longan）［21］等園藝植物上取得應用，為建立高效穩定的茶樹遺傳轉化體系提供新的思路。

本研究以去頂芽和腋芽的茶樹實生幼苗為轉化受體，利用根癌農桿菌侵染茶苗傷口，經抗性篩選獲得陽性茶樹轉基因植株。該茶樹原位轉化方法將為茶樹基因功能研究和種質創新奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟健康的‘鐵觀音’、‘白葉1號’和‘龍井43’茶樹實生幼苗來自福建農林大學南區茶山試驗基地。

根癌農桿菌（EHA105）和pCAMBIA1301質粒均由福建農林大學園藝植物生物工程研究所保存［22］。

1.2 方法

1.2.1 茶樹實生幼苗去頂芽和腋芽處理 用單蒸水清洗成熟健康的‘鐵觀音’、‘白葉1號’和‘龍井43’茶樹種子，直播于含有營養土（珍珠巖∶蛭石∶泥炭土=1∶1∶2）的塑料花盆中，置于光照培養箱25℃暗培養至含有4片真葉的茶樹幼苗，然后用消毒的切片刀切除頂芽和腋芽，保留真葉備用。

1.2.2 根癌農桿菌侵染液的制備 將根癌農桿菌菌液（攜帶pCAMBIA1301質粒）加入25 mL YEB（Yeast Extract Mannitol Broth）液體培養基（含有50 mg/L Kan和50 mg/L HYG）中，于恒溫搖床培養箱（28℃、轉速200 r/min）中暗培養。利用紫外分光光度計測定農桿菌菌液濃度，當OD600值達0.6-0.8時，使用高速離心機（轉速4 000 r/min，離心5 min）收集菌體。利用25 mL的MS（Murashige and Skoog）液體培養基（含10 mmol/L的MgCl2和100 μmol/L的AS）重懸收集獲得的菌體，于28℃振蕩培養，測定菌液OD600值至0.6-0.8時，用于后續侵染茶樹實生苗。

1.2.3 農桿菌侵染茶樹幼苗及共培養 用封口膜在切口周圍纏成漏斗狀，吸取根癌農桿菌菌液注入漏斗狀封口膜，以侵染切口。侵染40 min后，棄盛有菌液的漏斗狀封口膜。為防止切口失水，立即用封口膜封住切口保濕，置于培養箱中于28℃暗培養2 d。利用雙蒸水以相同的方法侵染茶樹幼苗作為陰性對照。

1.2.4 抗性芽篩選 打開覆蓋切口的封口膜，用蘸有60 mg/L的HYG溶液的棉簽擦拭切口處2次，并留下一滴HYG溶液后，重新用封口膜封住切口，于25℃培養箱中暗培養。當切口處長出抗性芽后再補光繼續培養至2-3片真葉，用于后續鑒定。

1.2.5 再生抗性芽的分子生物學鑒定 分別取0.1g抗性芽及未轉化的再生植株葉片，采用改良后的CTAB法提取茶樹基因組DNA［23］。以抗性芽gDNA為模板，利用GUS標記基因引物和HYG標記基因引物（表1）進行PCR檢測驗證。參考陳裕坤等［21］建立的PCR反應體系。以未轉化的再生植株gDNA為模板作為陰性對照。參照Zhou等［24］的基因克隆方法，將抗性芽擴增產物進行膠回收、連接轉化后委托鉑尚生物技術（福州）有限公司測序。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequenle information

1.2.6 陽性再生抗性芽扦插 當抗性芽長至10 cm左右，木質化程度約2/3時，用以扦插。剪取長度約3 cm帶有一片成熟葉和一個飽滿腋芽的穂條，確保剪口平滑，與母葉呈平行的斜面。為提高插穗的成活率，將剪口浸在62.5 g/L的生根粉溶液中1min，然后斜插于被水浸潤的穴盤營養土中，深度為穗條長度的2/3至葉柄與土層表面平齊。邊扦插邊將插穗附近的土稍壓實，扦插后立即澆水，置于25℃溫室中暗培養。

1.2.7 轉基因植株回收處理 對轉基因過程中所使用的各類材料包括穴盤、封口膜、鑷子、侵染液和營養土等進行回收與滅菌處理，防止轉化的質粒向環境釋放。

2 結果

2.1 茶樹抗性芽再生

約3周齡茶樹實生幼苗長至含有4片真葉，且尚未木質化時可進行去頂芽和腋芽處理，利用根癌農桿菌菌液侵染傷口，共培養2 d后，即利用HYG進行抗性篩選，最終抗性芽再生率超過90%，共獲得299個抗性芽（圖1）。暗培養2-3周后，所有抗性芽均從茶苗腋芽的傷口處再生，且每株都只能長出一個抗性芽，去頂芽的傷口處無一長出再生芽。當植株長出抗性芽之后，再對茶苗進行光照培養。約2-3周后，抗性芽逐漸長大，當擁有2-3片葉時，可對其進行陽性鑒定。

2.2 轉基因茶樹再生芽陽性鑒定

獲得的299個抗性芽中，‘鐵觀音’、‘白葉1號’和‘龍井43’再生芽分別為86、134和79個，分別取所有再生芽的葉片0.1 g用以提取gDNA后進行分子生物學鑒定。結果表明，不同茶樹品種轉化率有所不同，‘鐵觀音’轉化率最高，達到8.14%（7/86）；‘白葉1號’次之，轉化率為2.99%（4/134）；‘龍井43’的轉化率最低，為2.53%（2/79）。所有陽性再生芽中，GUS和HYG標記基因經多次PCR檢測仍為陽性（圖2），且PCR擴增產物測序結果與GUS和HYG片段序列一致，表明PCR檢測結果可信度高。

圖2 轉基因植株的標記基因檢測Fig. 2 Detection of marker genes in the transgenic plants

2.3 轉基因植株扦插

當再生芽長至10 cm左右，且有2/3木質化時，即可剪取穂條進行短穗扦插（圖1-I，J），扦插后的轉基因插穗的生長和發育狀況正常，能長出新芽。插條生長過程中，又對其進行多次標記基因的PCR鑒定，結果依舊為陽性，表明利用茶樹原位轉化獲得陽性再生芽后，可通過扦插方式快速獲得茶樹轉基因植株。

圖1 茶樹轉基因植株的獲得Fig. 1 Process of obtaining transgenic tea plants

3 討論

迄今，茶樹基因功能研究主要通過體外試驗或依賴于擬南芥、煙草等模式植物的異源表達系統進行驗證［25］。然而，生物合成網絡具有復雜性、多樣性及特異性。例如，茶樹富含兒茶素、茶氨酸及咖啡堿等多種特異代謝物［1］，在擬南芥或煙草體內往往缺乏相關合成底物，使得異源表達系統不適用于茶樹特征基因功能鑒定及調控關系研究。與模式植物相比，茶樹基礎分子理論的研究相對薄弱，這也制約了突破性茶樹新品種定向選育。針對以上問題，Zhou等［26］建立了一種高效、簡便的茶樹葉肉細胞原生質體提取方法，可廣泛應用于茶樹特征次生代謝物合成調控基因的瞬時表達研究。然而，茶樹仍舊缺乏一套高效穩定的永久轉化體系。

目前，茶樹轉基因主要通過依賴組織培養的農桿菌介導法，但大量研究發現茶樹體內富含抑菌性多酚類物質是建立高效、穩定茶樹遺傳轉化體系的主要障礙［11-12，27-28］。一方面，茶樹組織培養過程中，外植體組織會釋放大量酚類物質，進而聚合成暗黑色的大分子化合物，導致外植體產生嚴重褐化，影響再生植株誘導［29］；另一方面茶多酚具有強力的抗菌作用，在轉化過程中會抑制農桿菌活性，進而影響轉化率［30］。此外，茶樹組織培養誘導體胚難度較大、體胚成熟和萌發所需時間較長，也嚴重影響了轉基因效率［11］。綜上，現有的茶樹轉基因體系仍舊無法突破轉化效率低，再生能力差的瓶頸。本研究建立的茶樹原位轉化方法無需準備茶樹無菌試管苗，無需誘導胚狀體，無需繼代轉接抗性芽，與現有的茶樹轉基因技術相比，具有操作步驟簡便，實施成本低，試驗周期短等優點。

茶樹原位轉化具體實施過程中，抗性芽再生率是農桿菌介導的原位轉化能否成功的關鍵因素。本研究利用可拉伸的封口膜，在茶樹切口處纏繞成漏斗形后進行農桿菌侵染，可使菌液既不外漏又可與傷口充分接觸，提高了轉化效率。在共培養階段，維持植株被侵染傷口的濕度對抗性芽再生至關重要［31］。在沙田柚的原位轉化研究中發現，傷口被封口膜包裹的幼苗能比傷口沒有被包裹的幼苗再生更多的抗性芽［19］。其次，農桿菌侵染植株傷口后進行暗培養也是促進抗性芽再生的重要措施，研究表明暗培養有助于柑橘轉基因抗性芽再生［31-32］。因此，本研究利用封口膜包裹經HYG篩選后的茶樹幼苗傷口同樣可起到保濕的效果，并且在共培養之初，同樣采用暗培養，在此基礎上茶樹抗性芽再生率可達到90%以上。待到長出再生芽之后再進行光照培養可加快再生芽的生長速度。此外，本研究發現茶樹抗性芽只能從去腋芽的傷口處再生，推測是由于去腋芽的傷口處生長代謝旺盛，芽的再分化能力強，容易誘導不定芽。因此，對去腋芽處的傷口進行侵染有利于提高轉化率。

扦插是利用植物“細胞的全能性”進行快速無性繁殖的方法，也是現階段茶樹育苗的主要手段，具有繁殖系數大，發根成苗快的優點［33］。建立原位轉化方法獲得轉基因再生芽后，通過短穗扦插可獲得生長和發育狀況正常的扦插苗，因此，每一個陽性的再生芽即為一個轉基因株系，與依賴組培的傳統轉基因方法相比，大大加速了獲得轉基因植株的周期。綜上所述，本研究建立的茶樹原位轉化方法為茶樹基因功能研究和種質創新奠定堅實的基礎。

4 結論

本研究針對茶樹缺乏高效、穩定的遺傳轉化體系問題，建立了一種不依賴組織培養的茶樹原位轉化轉基因方法。經過抗性篩選，成功獲得轉基因再生芽。‘鐵觀音’、‘白葉1號’和‘龍井43’的轉化率分別為8.14%、2.99%和2.53%。剪取轉基因再生芽進行短穗扦插，插穗的生長和發育狀況正常，可成功獲得茶樹轉基因植株。