重組酶聚合酶擴增技術在植物病毒檢測中的應用

羅雪琮 安夢楠 吳元華 夏子豪

（沈陽農業大學植物保護學院，沈陽 110866）

在過去幾十年中，占植物病害數量第二位的植物病毒病一直制約著糧食、果蔬等作物的產量［1］。因此，快速準確地檢測植物病毒是病害防控工作中的重要部分［2］。常見的病毒檢測方法有生物學測定、電子顯微鏡觀察、血清學檢測與分子生物學技術等多種手段。其中，生物學測定技術是利用病毒的寄主范圍、傳播方式與侵染后寄主的反應而檢測病毒的方法［3］。該方法具有直觀、可靠、反映病毒生物學特性的優點，但選擇指示植物較復雜，目前已不再是植物病毒檢測的主要手段［4］。電鏡檢測主要通過觀察病毒結構和宿主細胞結構的變化來確定病毒的種屬，需要價格高昂的電子顯微鏡，且不易分辨親緣關系近的病毒。血清學檢測法的原理則是抗原與抗體的特異性結合，常用方法包括酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA）、用硝酸纖維素膜取代酶聯板以簡化程序的點免疫結合測定技術（dot immunobinding assay，DIBA）及膠體金標記的抗體檢測技術。但血清學檢測法需要特異的抗體，且不能準確鑒定病毒含量低和具有大量干擾物質的樣品，易產生假陽性結果［5］。另外，隨著分子生物學的發展，核酸分子雜交技術、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、深度測序技術等逐漸發展成為常用的病毒檢測方法。分子生物學檢測法具有靈敏便捷、特異性強、檢測范圍廣等優點，但也具有設備與材料成本高等局限性［6］。

近年來，學者們還開發出一些基于特殊酶類的等溫擴增方法，如：環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、核酸序列擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、單引物等溫擴增（single primer isothermal amplification，SPIA）、重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）和滾動循環擴增（rolling circle amplification，RCA）等，為病毒的檢測提供了技術支持［7］。其中，RPA技術是一種時間成本較低、適用于資源有限的現場檢測方法，從眾多需要較復雜材料或儀器的檢測方法中脫穎而出，其優點明顯，應用范圍也越來越廣。本文綜述了RPA技術的原理、研究進展及存在的問題，總結了目前RPA在植物病毒鑒定領域的發展情況，為其在植物病毒檢測中的應用提供參考。

1 重組酶聚合酶擴增（RPA）

RPA是一種新型的核酸等溫擴增技術［8］。與PCR類似，RPA的反應體系中除核心酶外，還要加入引物與模板，另外還需Mg2+。RPA的檢測過程主要包括樣品核酸提取，引物設計與篩選，運用反應試劑盒進行擴增以及將結果可視化。目前研究人員運用RPA檢測技術常用的試劑盒主要是其發明者TwistDx公司的TwistAmp 以及美國公司Agdia的AmplifyRP 系列產品。

1.1 RPA的原理

RPA體系中含有3種重要的核心酶，包括重組酶、單鏈結合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）和DNA聚合酶。重組酶可以與引物結合形成核酸蛋白復合體并定位模板，引發鏈交換反應形成D環結構，SSB穩定被置換的DNA鏈，隨后DNA聚合酶識別重組酶解離后暴露出的引物3′端，由此開始擴增［9］。DNA聚合酶在延伸引物的同時對模板進行解螺旋，DNA的合成持續進行，直至兩條引物擴增完成即形成完整的擴增子（圖1）［10-11］。通過使用一對引物，如果存在目標序列，則可以在最佳溫度（37-42℃）下啟動DNA的指數級擴增，適用于病毒基因組DNA或RNA的快速檢測［7］。RPA擴增體系中一般還含有促進重組酶同源重組的成分：如T4 uvsY，更有利于RPA反應的進行［8］。

圖1 RPA原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of RPA principle［11］

1.2 RPA引物的設計要求

引物設計是RPA技術的關鍵步驟，為擴增反應的正常進行奠定基礎。其設計過程主要由選擇靶區域、設計引物候選物與實驗篩選3個步驟組成［11］。由于RPA引物的設計過程較為復雜，目前還沒有適用的設計軟件。不同于PCR引物的設計，為了方便重組酶與引物形成復合物，RPA引物的建議長度一般在30-35 nt。過短的引物會降低反應的重組率，過長的引物則易產生二級結構以及潛在的引物假象［12］。另外，引物應沒有直接或倒置重復、回文序列以及二級結構（包括環和發夾結構）等，且在5′端不應有長鏈鳥嘌呤，GC含量應在30%-70%之間［7］。RPA技術發展至今，可擴增dsDNA、ssDNA以及RNA或miRNA逆轉錄得到的cDNA［13］。無論使用什么模板，為了獲得最佳結果，RPA引物應擴增較短的擴增子，最好控制在100-200 bp。雖然RPA也曾報道過較長的擴增子（1.5 kb）［8］，但通常情況下，RPA的擴增產物長度應高于70 bp且低于500 bp。如果需要設計實時熒光定量RPA（real-time RPA）所使用的探針，則需在設計引物時留下足夠的空間［14］。

1.3 RPA的優缺點

目前常用的植物病毒檢測方法中，PCR技術需要較昂貴的熱循環設備；ELISA需要的抗體制備時間較長，易產生假陽性結果；LAMP引物設計復雜；實時熒光PCR快速、靈敏但設備成本較高［15］。在實地調查或條件比較有限的檢測環境下，PCR等技術應用困難［16］。相比而言，RPA技術的優點包括：（1）RPA檢測所需時間短，30 min左右即可完成反應；（2）RPA樣品處理方法簡單，適用于無法提取核酸的實地檢測，可以擴增提取的DNA、RNA以及樣品粗提物；（3）常溫下重組酶也有活性，因此RPA技術不需要熱循環器，在常溫（37-42℃）條件下即可恒溫擴增，只需水浴、金屬浴或恒溫孵化器即可在現場條件下完成反應；（4）與其他的核酸擴增方法（PCR、RT-PCR等）相比，RPA的靈敏度更高或持平；（5）RPA具有較高的特異性，檢測時不易與其他病毒發生交叉反應［17］；（6）RPA能夠耐受試驗樣品中的各種擴增反應抑制劑［18］。

如今RPA檢測方法應用廣泛，優勢明顯但也具有一定的局限性。RPA產物檢測方面，在瓊脂糖凝膠電泳之前需要進行純化，因此造成時間和成本的增加；側流層析試紙條法（lateral flow dipstick，LFD）需要將產物稀釋后再使用試紙條進行結果的檢測，以防反應底物的干擾；在實時熒光定量RPA技術中，需要使用熒光檢測儀對結果進行監測，因此也具有較高的儀器成本。另外，由于缺少RPA引物設計的軟件，需經過大量的篩選才有可能獲得理想的引物，建立特定核酸檢測方法的開發時間與費用成本較高。

2 RPA的發展

RPA在不斷的發展過程中，獲得了更多的研究和開發策略，也為資源較差的實驗室提供合適的快速檢測方法。對于RNA病毒的檢測來說，需在體系中加入逆轉錄酶，將RNA作為模板合成cDNA再進行擴增，RPA結合逆轉錄法形成逆轉錄RPA技術（reverse transcription-RPA，RT-RPA）。RPA與 其 他方法的結合也使其發展地更加豐富。

2.1 RPA結合瓊脂糖凝膠電泳

RPA經過擴增得到的產物DNA可以通過瓊脂糖凝膠電泳使結果可視化。需要注意的是，在瓊脂糖凝膠電泳檢測時，由于RPA反應的混合物中存在阻礙擴增子可視化的蛋白質，以致形成拖帶，所以RPA產物需經過酚-氯仿抽提或產物純化等方法，去除酶等干擾成分才能進行電泳，從而形成更好的成像結果。電泳后將瓊脂糖凝膠經過溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色，通過凝膠成像儀在紫外光下獲得擴增條帶的可視化結果［7］。RPA結合瓊脂糖凝膠電泳是實驗室內植物病毒檢測常用的方法之一，已在多個植物病毒檢測中得到應用。例如葡萄卷葉伴隨病毒3號（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）等［15］。

2.2 RPA結合側流層析試紙條

目前，利用RPA方法的部分研究中，將RPA擴增反應與側流層析試紙條相結合，以獲得可視化結果。與普通RPA體系不同，RPA-LFD需要額外加入核酸外切酶Ⅳ（nfo核酸酶）、帶有FAM熒光素標記的nfo探針以及帶有生物素（biotin）標記的下游引物［19］。RPA反應過程中，重組酶與引物（正向引物和帶有生物素標記的反向引物）形成復合物并結合同源鏈發生鏈置換反應，在DNA聚合酶的作用下進行擴增；同時，帶有生物素標記的擴增產物能夠與nfo探針雜交，含有四氫呋喃（THF位點）的nfo探針被nfo核酸酶識別并切割，產生的羥基端與DNA聚合酶結合形成新的延伸底物，最終擴增得到3′端含生物素、5′端含FAM的雙標記擴增子［20］。

測流層析試紙條可利用膠體金免疫層析原理的“夾心法”進行檢測［21］。LFD前端含有FAM熒光標記，試紙條上有一條帶有生物素抗體的檢測線和一條包被固定抗體的對照質控線［14］。當擴增產物流過試紙條時，在擴散過程中通過抗原抗體結合的原理與FAM抗體以及生物素抗體結合形成免疫復合物［22］。在測試區，含生物素的復合物于檢測線被生物素配體捕獲并顯出紅色，未被捕獲的免疫復合物擴散至對照區，被固定抗體捕獲并形成紅色條帶［23］。RPA-LFD一般在30 min內即可完成擴增與可視化檢測，觀察檢測線和質控線形成的條帶即可判斷檢測結果，若未顯示對照線（control line）則結果無效［20］。另外，反應底物可能會干擾試紙上的抗體，因此需注意RPA產物應經過稀釋再進行試紙條檢測［14］。

RPA-LFD在植物病毒檢測中的應用較為常見。在紫云英矮縮病毒（milk vetch dwarf virus，MDV）的檢測過程中發現，當RPA結合瓊脂糖凝膠電泳與測流層析試紙條時檢測限一致，并比PCR結合瓊脂糖凝膠電泳靈敏100倍。當進一步試驗PCR結合測流層析試紙條時，其靈敏度與RPA相同。這表明測流層析試紙條在檢測MDV的PCR產物時比瓊脂糖凝膠電泳更靈敏［24］。測流層析試紙條操作快速簡便，不需要精密儀器，其靈敏度等于或高于瓊脂糖凝膠電泳，十分適合植物病毒的現場檢測。

2.3 RPA結合探針法熒光定量

與熒光定量PCR（real-time PCR）的原理相同，為實時監測RPA擴增的情況，可以將含有熒光標記的探針加入擴增體系中，通過檢測反應中的熒光信號觀察擴增過程中產物積聚的變化情況。在傳統PCR常用的TaqMan探針法中，Taq酶具有5′-3′的外切酶活性，以此來切斷探針鏈產生熒光［25］。在RPA反應過程中，Taq酶則會降解被置換的核苷酸鏈，因此這種探針影響DNA的擴增，不適合熒光定量RPA的反應［11］。在RPA檢測技術常用的探針中，Exo與Fpg探針一般應用于實時熒光定量的檢測，LF探針則可以運用在側流層析試紙以及凝膠電泳的檢測中。其中，Exo與LF探針一般建議在46-52個核苷酸之間，Fpg 探針通常為35個核苷酸。在RPA反應中可以對探針的濃度進行優化，其濃度范圍可在50-150 nmol/L，其推薦濃度為120 nmol/L［19］。

結合探針的RPA擴增過程中需要來自大腸桿菌的核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ，exo）和exo熒光探針的加入。Exo探針與靶序列具有同源性，其上含有THF位點，THF兩側分別攜帶一個熒光基團（fluorophore）和一個熒光淬滅基團（quencher），3′端有阻斷物以防探針延伸。Exo探針能夠結合靶序列形成雙鏈雜合DNA結構，隨后核酸外切酶Ⅲ識別THF位點并切割探針，兩基團分離并產生熒光信號［26］。目前，結合exo探針法的熒光定量RPA在植物病毒檢測領域中已有應用，例如利用RT-exoRPA檢測黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、玫瑰叢簇病毒（rose rosette virus，RRV）等［27-28］。該技術一般使用熒光定量PCR儀、Twista等能夠監測熒光信號的裝置來完成定量檢測，反應只需不到20 min，比瓊脂糖凝膠電泳更方便快捷，利于實驗室快速檢測植物病毒，具有較高的靈敏度與特異性［29］。未來研究將繼續開發適應現場檢測的熒光定量RPA技術，以更好地控制和減少病毒的傳播。

2.4 RPA結合金納米粒子（AuNP）探針與比色法

近年來，基于DNA的新型便攜式生物傳感器作為一種快速而靈敏的診斷工具被用來定性或定量檢測病原物［30］。研究人員將RPA與金納米粒子（AuNP）探針相結合開發出一種新的視覺診斷方法，利用肉眼進行AuNP聚集的比色檢測，成為一種可靠手段以促進AuNP探針在DNA檢測中的應用［31］。該視覺診斷方法主要包括3個步驟：RPA、AuNP探針雜交以及視覺檢測。首先利用RPA擴增目的片段，然后將AuNP探針加入到RPA反應體系中，并與H2NOH和HAuCl4混合促進AuNP的生長。DNA的數量和序列相似性會影響AuNP的生長與其大小形狀，而它們大小和形狀的不同會擁有不同的顏色與紫外或可見光譜［32］。

用生物傳感器AuNP探針識別RPA擴增子能夠形成不同顏色的可見溶液，如紫紅色，紫色，藍紫色，深藍色［31］。RPA結合AuNP探針與比色法應用于番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）的檢測中，方法簡單，反應時間較短（共20 min），通過觀察AuNP的顏色變化快捷簡便地用肉眼完成DNA的可視化檢測，且具有較高的靈敏度［31］。這種技術提供了一種植物病毒檢測結果可視化的新方法，可以提高AuNP聚合的比色檢測在定性和定量分析中的可靠性，從而促進AuNP探針在DNA檢測中的應用，在植物病毒檢測的發展過程中具有一定潛力。

2.5 RPA結合CRISPR/Cas系統

研究人員最初在大腸桿菌中發現了規律間隔成簇的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）的 存 在，后 來又發現了CRISPR相關蛋白（CRISPR associated protein，Cas）。近年來，CRISPR/Cas系統廣泛應用于基因工程、分子免疫以及轉錄調控中［33-35］。如今，RPA可與CRISPR/Cas技術結合起來，用于快速簡便地檢測病毒核酸，且RT-RPA-CRISPR/Cas12a已被開發并應用于植物RNA病毒的檢測［36-37］。該技術首先通過RT-RPA于等溫條件在單獨離心管中擴增目標序列，而后將擴增產物轉入含有Cas12a、crRNA等檢測試劑的新管中，CRISPR/Cas12a激活核酸酶活性并進行檢測［37］。將RPA與CRISPR/Cas12a相結合的檢測技術具有高特異性與敏感性，在植物病毒檢測領域還屬于有待發展的新技術。

3 RPA在植物病毒檢測中的應用

近年來，RPA技術被廣泛應用于生物學、醫學、動植物研究等許多領域的各類核酸的檢測中［38］。RPA于2006年首次報道，直到2014年才開始運用在植物病毒檢測領域，發表文獻數量在發展初期沒有明顯增長，2017年之后文獻數量逐年呈上升趨勢。可見在各類研究中已發展成熟的RPA在植物病毒檢測方向還是一個新興的技術，直到近幾年才產生較大影響并逐漸成為熱點。

不斷發展的RPA與其他檢測手段相結合，逐漸成為代表性的恒溫擴增方法，已應用于多種植物病毒的檢測中（表1），并在不斷改進中成為一種被許多研究學者運用的重要手段。截至2021年1月31日，通過在NCBI PubMed以及知網數據庫的檢索，將RPA在植物病毒及類病毒中應用的中文與外文文獻總結成表，共包含46篇文獻（圖2），檢測出35種植物病毒及4種類病毒。

圖2 植物病毒領域發表的RPA相關文獻數量Fig. 2 Number of RPA-related literature published in the field of plant viruses

表1 RPA在植物病毒檢測中的應用Table 1 Application of RPA in plant virus detection

續表 Continued

在植物病毒檢測中，溫度與反應時間是RPA技術最常見的優化方向，大多數研究都將溫度控制在37-42℃的范圍內，反應時間則主要集中在20-40 min。在靈敏度方面，RPA技術的檢出限能夠達到10-7稀釋度的RNA、1拷貝的DNA或1 fg的RNA體外轉錄物。RPA技術的一大優勢是在樣品的準備過程中，除利用核酸提取試劑盒提取RNA或DNA之外，還可使用較為便捷的粗提物作為模板，避免復雜的樣品制備過程，減少時間成本，適合應用于條件有限的現場檢測［74］。

經過十幾年的發展，RPA技術已經在世界上成功應用于動植物病原體、轉基因生物等多領域的分子檢測與鑒定中。植物病毒為害農作物并在世界范圍內造成重大經濟損失，許多基于RPA的方法被開發用于檢測不同植物病毒，這些報道已成為植物病毒學發展的重要基石。相比需要核酸提取等試劑盒與熱循環儀器的PCR等分子檢測手段，作為一種成功的替代方法，RPA不但特異性、靈敏度高，還能加快植物病毒檢測的過程，顯著降低時間與人力成本，有助于減少植物病毒的傳播并限制病毒的流行［41，69］。不過，RPA還存在一些問題有待進一步發展，如引物設計軟件的開發等。即便如此，RPA作為一種簡單快捷的檢測技術，已成為植物病毒檢測研究中一筆寶貴財富。

4 結語

RPA技術最大的潛力是方法相對直接簡便，不具備相關技能的人員也能迅速掌握，未來在田間植物病毒檢測應用中具有廣闊的前景。基于其穩定性、靈敏性、便捷性，RPA被稱為有望替代甚至超越PCR的技術，已經進入飛速發展時期。雖然目前RPA試劑成本比PCR高，但其時間與人力成本相對較低，相信在不斷深入研究后可降低試劑成本，獲得更加完善的反應裝置與技術，在植物病毒檢測領域更好地應用與發展。