花生籽仁中蔗糖含量近紅外預測群體模型的建立及在突變體篩選中的應用

卞能飛 童 飛 鞏佳莉 孫東雷 沈 一 王 幸 邢興華 王曉軍,*

(1 江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所，江蘇 徐州 221131；2 江蘇省農業科學院經濟作物研究所，江蘇 南京 210014)

花生(ArachishypogaeaL.)是重要的油料作物和經濟作物。我國花生年均總產量約1 690萬噸[1]，居世界第一[2]，其中約50.3%用于榨油[3]。近年來，花生消費呈現多元化趨勢，以花生為原料的食品需求量不斷上升[4-5]，我國鮮食、烘烤等食用花生消費比例由原來的30.0%左右逐步提高到39.6%[3]，而歐美等發達國家用于食用和食品加工原料的花生比例更是高達70%以上[6]，其中只有13.0%用于榨油[3]。食用花生消費比例快速提升且潛力巨大，這對花生品種的食味品質提出了更高的要求。我國在花生育種中較多關注產量和含油量，對花生食味品質關注度低，導致生產上缺乏優質食用型花生品種。

前人研究發現，花生籽仁的甜度與食味品質呈顯著相關性，兩者的相關系數高達0.88，其中蔗糖是籽仁甜味的主要來源[7-8]。Coleman等[9]研究表明，烘烤花生的風味物質主要來源于氨基酸與糖之間的美拉德反應、脂肪的氧化和熱降解及糖的熱降解反應3個方面，花生中蔗糖含量越高，烘烤花生的風味越好，這個趨勢在花生蔗糖含量高于5%時尤為顯著。王傳堂等[10]、羅虹等[11]研究表明，甜味是評價鮮食花生總體喜歡度，最重要的指標，且當籽仁中蔗糖含量大于6%時，帶殼水煮的鮮食花生更受歡迎。

高蔗糖含量是食用花生育種的主要目標性狀，如何快速、高通量地檢測種質資源和育種品系中的蔗糖含量，是高蔗糖育種工作中的首要問題。近紅外光譜分析技術是近幾年發展起來的一項物理測試技術，具有成本低、檢測快、不損壞樣品等優點，已被廣泛應用于水稻[12-14]、油菜[15]、玉米[16]等農作物的品質分析。在花生品質分析中，水分[17]、脂肪含量及脂肪酸組成[18-19]、蛋白質含量及氨基酸組成[20]等近紅外檢測技術較為成熟，籽仁中蔗糖含量檢測的應用研究還較少。雷永等[6]和唐月異等[21]分別利用美國 Unity的 SpectraStar XL型近紅外光譜儀和德國布魯克Matrix-I型傅立葉變換近紅外光譜儀構建花生籽仁的蔗糖含量近紅外模型，但無法在其他公司生產的光譜儀上應用。秦利等[22]對72份花生材料采用偏最小二乘法(partial least squares, PLS)建立適用瑞典波通DA7200型近紅外分析儀的蔗糖預測模型，但品種數量較少，準確度有待提高。

為了建立更準確的適用于波通DA7200型近紅外分析儀的花生籽仁蔗糖含量近紅外預測模型，本研究選用149個花生品種(系)，利用波通DA7200型近紅外分析儀采集光譜數據，間苯二酚法測定籽仁蔗糖含量，采用PLS建立預測模型，旨在為花生食味品質種質資源的篩選和育種提供高效、無損的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于建立籽仁蔗糖含量預測模型的標準樣品集材料為我國各產區選育的花生品種(系)和外國引進的品種共149份籽仁(表1)，模型外部驗證樣品集T1～T20為江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所選育的20個高代品系單株籽仁。

表1 建模所用花生品種(系)及其蔗糖含量化學值Table 1 The peanut accessions and their chemical values of sucrose content used for developing near infrared(NIR) model

表1(續)

1.2 試驗方法

1.2.1 標準樣品集光譜采集 采用瑞典波通DA7200型近紅外品質分析儀對樣品進行光譜信息采集。采集光譜前，所有樣品需自然風干至含水量5%以下，于密閉環境中放置48 h以上，平衡水分。光譜儀掃描波長范圍950～1 650 nm，分辨率5 nm，挑選飽滿籽仁裝滿樣品杯，輕輕搖勻，掃描3次，重新裝樣后重復2次，每個樣品共得到9次掃描結果。

1.2.2 標準樣品集蔗糖含量測定 采用間苯二酚法[23]測量蔗糖含量。使用DFT-50型磨樣機(林大機械有限公司，臺州)研磨籽仁成粉末狀，稱取50 mg 樣品(重復3次)放入離心管中，加入3 mL 80%乙醇溶液作為提取液，13 000 r·min-1離心15 min，取上清液，重復3次，合并上清液，80%乙醇溶液定容至9 mL 作為待測液。取待測液0.15 mL，加入0.15 mL 2 mol·L-1NaOH溶液，混勻，沸水浴10 min，冰水冷卻，加入2.1 mL 30%鹽酸和0.6 mL 0.1%間苯二酚溶液，混勻，80℃水浴10 min，冰水冷卻，于480 nm波長處比色測定，記錄OD值，根據標準曲線查得反應液中的蔗糖含量，計算樣品中蔗糖含量。

籽仁中蔗糖含量=[標準曲線查得蔗糖的量(μg) × 定容體積(mL)]/[反應液體積(mL) × 樣品重量(g) × 106] × 100%。

1.2.3 模型構建 該步驟在波通DA7200型隨機附帶建模軟件中完成。采用導數(derivative)處理和標準正態變換(standard normal variate transform, SNV)對標準樣品集光譜信息進行預處理，將光譜信息與間苯二酚法測定的籽仁蔗糖含量建立相關關系，用PLS建立預測模型，反復采用內部交叉驗證剔除奇異值。通過模型的校正決定系數(R2)、交叉檢驗決定系數(cross-validation correlation coefficient, 1-VR)、校正標準偏差(squared error of calibration, SEC)和交叉檢驗標準偏差(standard error of cross-validation, SECV)來衡量模型的質量。

1.2.4 模型外部驗證 選取20個育種高代品系的單株籽仁，利用新建預測模型對籽仁中蔗糖含量進行預測，采用間苯二酚法測量籽仁中蔗糖含量，比較近紅外預測值和化學值的相關性和準確性。

1.2.5 模型應用 2017年春，以甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS) 誘變徐花17號得到誘變1代(M1)，種子混收。2018年春，單粒播種，分單株收獲誘變2代(M2)，獲得籽仁1 965份。運用建立的近紅外預測模型對1 965份M2代單株籽仁中蔗糖含量進行測定，采用Excel 2013進行數據整理，采用SPSS 20.0完成數據分析。

2 結果與分析

2.1 花生籽仁的近紅外反射光譜分析

149份標準樣品籽仁在950～1 650 nm區間內的近紅外光譜曲線趨勢大致相同，均存在多個吸收峰，但不同的樣品吸收峰強度不同(圖1)，表明花生籽仁的近紅外光譜可以用于花生籽仁中蔗糖含量的定量分析。

圖1 花生籽仁樣品的近紅外掃描光譜圖Fig.1 Near infra-red (NIR) spectrums of peanut kernel samples

2.2 花生籽仁蔗糖含量化學測定

149份標準樣品籽仁中蔗糖含量詳見表1，蔗糖含量均值為3.54%，含量范圍為2.15%～7.93%，變異系數為22.03% (表2)，蔗糖含量的變幅較寬，變異系數較大，滿足建立近紅外模型的要求。

表2 花生籽仁中蔗糖含量的化學測定結果Table 2 Chemical determination of sucrose content in peanut kernel

2.3 近紅外模型構建

對149份標準樣品籽仁中蔗糖含量的化學值和采集的近紅外光譜數據進行擬合光譜處理，采用PLS法的化學計量學方法建立預測模型。得到的校正決定系數(R2)為0.898，交叉檢驗決定系數(1-VR)為0.792、校正標準偏差(SEC)為0.253，交叉檢驗標準偏差(SECV)為0.363(表3、圖2)。模型的決定系數較高，標準誤偏差較小，表明該蔗糖含量檢測模型可以進行有效預測。

表3 花生籽仁中蔗糖含量的近紅外定標參數Table 3 Parameters of NIR calibration for sucrose contents in peanut kernel

圖2 蔗糖含量的近紅外與化學測定散點圖Fig.2 Scatter diagram between NIR and chemical value of sucrose content

2.4 模型外部驗證

選取20個育種高代品系的單株籽仁進行外部驗證，蔗糖含量的化學值和預測值見表4，經配對t檢驗，t=0.464

表4 花生種子蔗糖含量近紅外模型的驗證Table 4 Validation of near infrared model for sucrose content in peanut seed

圖3 外部驗證花生樣品的蔗糖含量預測值與化學值的相關性Fig.3 The coefficient of determination of sucrose content between NIR and chemical values in the external peanut samples

2.5 預測模型在突變體篩選中的應用

徐花17號是由江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所選育的小果型炒貨花生品種，在蘇北地區種植面積較大，籽仁中蔗糖含量的化學值為4.33%。為進一步改善徐花17號的食味品質，使用EMS對徐花17號種子進行誘變，利用建立的籽仁中蔗糖近紅外模型對M2單株籽仁進行預測。徐花17號的近紅外預測值為4.07%，M2單株的預測平均值為4.12%，略大于徐花17號，預測范圍為2.33%～6.45%，符合正態分布(表5、圖4)，其中預測值大于徐花17號的有1 038份，大于5.00%的有71份，大于6.00%的有4份。4份預測值大于6.00%的突變體經化學法驗證，其蔗糖含量分別為6.12%、6.18%、6.37%和6.63%，通過多人品嘗評價，籽仁甜味度優于徐花17號，證明在育種實踐中，該模型適用于突變體、種質資源、雜交后代等籽仁甜味的篩選，可提高優質食味品種的育種效率。

表5 M2單株籽仁蔗糖含量近紅外預測值Table 5 Sucrose contents of M2 by NIR test

圖4 M2單株蔗糖含量近紅外預測值分布圖Fig.4 Histogram of sucrose content of M2 by NIR test

3 討論

花生籽仁品質是花生育種的重要組成部分，花生籽仁中不同成分的含量決定了花生的加工品質、營養品質和食味品質，傳統的化學檢測方法費時費力，需要損壞花生種子，很難在種質篩選和品質育種中起到作用[24]。近年來，近紅外分析技術在花生品質分析中快速應用[19-20]，針對不同的近紅外儀器型號，花生籽仁中各成分的預測準確度也越來越高。唐月異等[21]利用167份花生材料建立適用德國布魯克Matrix-I型近紅外光譜儀的蔗糖預測模型，決定系數R2為0.816；雷永等[6]利用185份花生材料建立適用美國 Unity的 SpectraStar XL型近紅外光譜儀模型，決定系數R2為0.962；秦利等[22]利用72份花生材料建立適用瑞典波通 DA7200型近紅外分析儀的蔗糖預測模型，決定系數R2為 0.822。不同研究模型的決定系數不同，與建模所用品種數量、蔗糖含量變異范圍、化學值準確度、儀器型號等因素有關。本研究建立的花生籽仁中蔗糖含量預測模型，其決定系數R2為0.898，校正標準偏差為0.253，提高了波通 DA7200型近紅外分析儀預測籽仁中蔗糖含量的準確性。但標準樣品集中蔗糖含量高的極端品種較少，對模型的準確度產生了一定的影響，下一步將繼續收集和創制極端種質補充至該模型，提高該模型的準確度。

傳統花生育種存在育種效率低、周期長的缺點[25]，特別是品質育種。在常規雜交育種過程中，低世代材料往往只進行表型農藝性狀選擇，綜合表現較好的高世代品系再進行品質性狀選擇，造成許多品質優良的材料被淘汰。本研究建立的預測模型適用于小樣品量單株籽仁的無損測定，育種早代即可選擇，增加品質育種的針對性，縮短育種年限。蔗糖含量預測模型可同已建立的脂肪含量、蛋白質含量、油酸含量等其他近紅外模型整合，單次試驗即可得到多種化學成分的檢測結果，便于育種者選育兼具高糖、高油酸、低脂、高蛋白性狀的食用花生新品種。

本研究建模所用的149個品種(系)是我國花生主產區推廣的品種，蔗糖含量大于5.00%的只有5個，大于6.00%的只有2個，可見我國花生品種中蔗糖含量普遍較低，高糖種質資源匱乏，同Wang等[26]的結論一致。為解決這一問題，可以通過兩條途徑：一是普通糖含量品種雜交產生超親現象，雷永等[6]在吉花 02-1-4(蔗糖含量4.00%)和中花 26(蔗糖含量2.30%)的雜交后代中篩選出一批蔗糖含量超過7.00%的優良品系，利用本研究建立的預測模型也在徐花紫1號(蔗糖含量4.77%)和四粒紅(蔗糖含量4.36%)雜交后代篩選出徐花甜29(蔗糖含量8.80%)和徐花甜30(蔗糖含量8.90%)2個高糖品系；另一種是利用誘變技術創制高蔗糖含量的種質資源，崔光軍等[27]、王秀貞等[28]分別通過花粉管通道法導入根癌農桿菌質粒和EMS誘變得到花生高蔗糖含量突變體；本研究篩選了徐花17號(蔗糖含量4.33%)經EMS誘變得到的M2單株籽仁，得到4份蔗糖含量大于6.00%的突變材料。

4 結論

本研究利用149個花生品種(系)，構建花生籽仁中蔗糖含量的近紅外預測群體模型，該模型的決定系數為0.898，校正標準偏差為0.253，通過外部驗證可以較準確地預測花生籽仁中的蔗糖含量。運用該模型篩選徐花17號誘變群體，從1 965份M2單株籽仁中獲得4份蔗糖含量大于6.00%的突變體。