棗園生草處理對土壤養分和細菌群落的影響

王中堂 沙建川 解小鋒 孟曉燁 趙登超 彭 玲 張 瓊,*

(1 山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2 山東省林業廳經濟林管理站，山東 濟南 250014；3 山東省林業科學研究院，山東 濟南 250014；4 濱州學院山東省黃河三角洲生態環境重點實驗室，山東 濱州 256600)

棗(ZizyphusjujubaMill.)是原產我國的重要果樹，果實營養價值極高，素有“活維生素丸”之美譽[1]。該樹種具有耐瘠薄與抗鹽堿的特性，是我國北部鹽堿地和瘠薄山區的主要經濟林樹種之一，為當地產生了較好的經濟效益、生態效益和社會效益。針對我國大部分棗園立地條件差，水肥流失嚴重的現狀，目前果園生草是一種優良的土壤管理制度[2]。果園生草是指在果樹行間(株間)或全園種植多年生禾本科或豆科草作為土壤覆蓋的管理措施，具有改良土壤質量、減少水分流失、促進果樹生長發育及改善果實品質、調節果園微域生態環境等優點，現已成為世界上許多國家和地區廣泛采用的果園土壤管理模式[3-8]。近年來研究表明，與清耕相比，果園生草可優化土壤微生物群落，加快土壤有機質分解，其中土壤細菌在礦質養分轉化和養分吸收中扮演著重要角色[9-11]。

我國果農主要采用節本增效的措施實現持續增收，因此明確適合我國國情的草種及其省力高效的生草模式，對果園生草技術的推廣應用具有重要意義。陳學森等[12]在蘋果園研究發現一年生豆科植物長柔毛野豌豆(ViciavillosaRoth.)與其他草種相比具有5個特點：一是具有固氮作用；二是適應能力強，在我國各地均有分布；三是具有冬小麥生長特性，即秋季播種后經一個冬季的冷凍處理，翌年春季可爬蔓生長，易蓋滿地面，不僅減少其他雜草生長，還可減少水分蒸發，具有保水保肥的作用；四是種子無休眠，浸水24 h后即可萌發生長；五是根系淺，莖木質化程度極低，且6月結豆莢后，植株很快腐爛，無需刈割。目前國內文獻報道中長柔毛野豌豆僅在蘋果園和梨園進行過種植效益評價[12-13]，在棗園中的相關研究尚鮮見。基于此，本研究通過田間試驗，探究了棗園種植長柔毛野豌豆對土壤綜合肥力、土壤細菌群落豐度和結構多樣性的影響，旨在為長柔毛野豌豆在棗園生草中的推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

試驗于2019年10月—2020年9月在山東省農業科學院果樹研究所泰東試驗基地進行，試驗地位于山東省泰安市(35°～36°N，116°～117°E)，屬北溫帶大陸性半濕潤季風氣候區，雨熱同季，主要集中在6—9月，年降水量約697 mm，無霜期195 d。土壤主要為黏質壤土，含有機質9.18 g·kg-1，硝態氮32.56 mg·kg-1，銨態氮20.42 mg·kg-1，速效磷15.12 mg·kg-1，速效鉀124.32 mg·kg-1，pH值7.7。

供試棗樹為自主選育的金絲4號新品種，10月上旬完熟，樹體5年生，株行距1.5 m×4 m，長勢良好。長柔毛野豌豆種子購自山東天地園藝科技有限公司。

1.2 試驗處理

試驗共設置3個處理：(1)果園清耕，試驗期間在清耕區及時清除雜草；(2)自然生草，當地自然生草群落主要為馬唐[Digitariasanguinalis(L.)Scop]、絲茅(茅草)[Imperatakoenigii(Retz.)Beauv.]、葎草(拉拉秧)[Humulusscandens(Lour.)Merr.]、中華小苦荬(苦菜)[Ixeridiumchinense(Thunb.)]、薺菜[Capsellabursa-pastoris(L.)Medic.]及稗[Echinochloacrusgalli(L.)Beauv. var.crusgalli]，試驗期間刈割3次，保持自然雜草高度15～20 cm，維持自然生草覆蓋；(3)種植長柔毛野豌豆，于2019年10月在棗樹行間(距主干30 cm以上)開溝播種長柔毛野豌豆種子，播種密度為22.5 kg·hm-2，長柔毛野豌豆開花時間為每年4—6月，7月后倒伏枯萎，落地種子9月初長出第二茬，一次播種可連續多年生長，試驗區域土壤為長柔毛野豌豆與少量自然雜草覆蓋。每個處理的面積均為667 m2，栽植3行棗樹，共110株，單行為1個重復。其他施肥、澆水、修剪以及整枝等管理措施均保持一致。

于2020年9月10日分別對各處理的行間和根際取土，行間取土利用土鉆取0～30 cm土層，取土位置為兩行棗樹的中間點。根際取土為小心挖出棗樹根系，收集附著在細根(≤2 mm)上的土，并去除較大顆粒土，即為根際土。每處理分別取3次重復，用于各指標測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤理化性質及酶活性測定 采用烘干法測定土壤含水量；采用殘渣烘干法測定土壤全鹽量；利用PHS-3C型pH計(雷磁，上海)測定土壤pH值；采用重鉻酸鉀外加熱法測定土壤有機質含量(soil organic matter，SOM)；采用凱氏定氮法測定土壤全氮含量(total nitrogen，TN)；利用AA3流動注射分析儀(天津中通科技發展有限公司)測定土壤硝態氮含量(NO3-N)；采用碳酸氫鈉-鉬銻抗比色法測定土壤速效磷含量(Olsen-P)；采用火焰光度法測定土壤速效鉀含量(available potassium，AK)；采用環刀法測定土壤容重(bulk density，BD)[14]。土壤脲酶活性采用苯酚鈉比色法測定，單位以NH3-N mg·g-1(37℃，24 h)表示；土壤蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，單位以mg·g-1(37℃，24h)表示；土壤堿性磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，單位以mg·g-1·d-1(37℃，24 h)表示；土壤堿性過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定容量法測定，單位以0.02 mol·L-1KMnO4mL·g-1(25℃，20 min)表示，蛋白酶活性測定采用銅鹽比色法，單位以NH3-N mg·g-1(37℃，24 h)表示[15]。

1.3.2 果實品質測定 于果實完熟期(10月5日)在樹體四周均勻選取果實，1株樹上選取5個果實，每個處理共選取30個果實，果實放入干冰盒中，及時帶回實驗室。可溶性糖含量用蒽酮比色法測定，可滴定酸含量用NaOH 滴定法測定，維生素C(vitamin C，Vc)含量用鉬藍比色法，類黃酮含量用紫外光分光光度法，硬度用TA.XT plus型質構儀(英國Stable MicroSystems公司)測定。

1.3.3 土壤細菌的16S rRNA測序及多樣性分析 土壤細菌的16S rRNA測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)法提取樣本總基因組DNA。利用特異性引物擴增土壤細菌16S rRNA V3+V4區片段，采用通用引物338 F(5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGCA-3′)和806 R(5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)擴增，產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，AXYGEN凝膠電泳切膠回收，擴增體系和反應程序參考Huws等[16]的方法，每個樣品3個重復。根據所擴增的16S區域特點，構建小片段文庫，基于Illumina NovaSeq測序平臺對該文庫進行雙末端測序。經過Reads拼接過濾，可操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類，進行物種注釋及豐度分析。基于OUTs聚類注釋結果，對其進行α多樣性分析和β多樣性分析。

1.4 數據分析

采用Excel 2019軟件進行數據處理和作圖，采用SPSS 17.0軟件進行數據的統計分析(單因素方差分析)，差異顯著性檢驗用最小顯著性差異法(least-significant difference, LSD)，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 棗園生草對土壤理化性質和土壤酶活性的影響

由表1可知，與清耕處理相比，棗園生草處理降低了行間和根際土壤pH值、含鹽量和容重，提高了行間和根際土壤含水量，以及全氮、有效磷、有效鉀和有機質含量，均以長柔毛野豌豆處理作用最明顯。行間和根際土壤pH值和有效磷含量在不同處理間無顯著差異，行間和根際土壤有效鉀和有機質含量在不同處理間存在顯著差異。長柔毛野豌豆處理對土壤有機質和全氮含量較清耕處理的提高幅度最明顯，行間土升幅為64.5%和71.9%，根際土升幅為57.3%和90.6%。

表1 棗園生草對土壤理化性質的影響Table 1 Effects of planting grass on soil quality characteristics in jujube orchard

如表2所示，棗園生草不同程度地提高了行間和根際土壤脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶和蛋白酶活性，均以長柔毛野豌豆處理提高幅度最高。與清耕處理相比，行間土分別提高了168.8%、16.6%、6.7%、52.3%、14.2%，根際土分別提高了104.5%、15.3%、10.3%、49.0%、17.1%，且行間和根際土壤的脲酶和堿性磷酸酶活性在不同處理間存在顯著差異，行間土壤的過氧化氫酶在不同處理間無顯著差異。可見長柔毛野豌豆有利于提高土壤脲酶和堿性磷酸酶活性。

表2 棗園生草對土壤酶活性的影響Table 2 Effects of planting grass on soil enzyme activities in jujube orchard

2.2 土壤細菌測序優化序列統計

土壤樣本測序結果統計表明(表3)，細菌共測定的有效序列條數為469 424，過濾掉低質量的序列后，得到優化序列總數為300 150，優化序列所占比例均大于61.0%。

表3 土壤樣本細菌測序結果統計Table 3 Sequencing data statistics of soil samples of bacteria

稀釋曲線表示高通量測序數據量是否涵蓋樣品中所有微生物類群，當曲線趨于平坦，說明測序數據量漸進合理，更多的數據量只會產生少量新的物種[17]。由圖1可知，6個土壤樣本的OTUs數目隨測序數據量的增加呈先快速上升后緩慢上升的趨勢，序列數量達36 220 時，各土壤樣本稀釋曲線均基本趨于平緩，表明測序深度合理，可以反映樣品中的物種組成。

圖1 土壤樣本細菌稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacteria of soil samples

2.3 棗園生草對土壤細菌群落結構的影響

2.3.1 土壤細菌α多樣性(Alpha diversity)分析 α多樣性反映樣本內的微生物群落的豐度和多樣性，其中香農指數反映樣品中的分類總數及其占比，辛普森指數反映樣品群落的多樣性，Chao1指數和ACE指數反映樣品中群落的豐度[18-19]。由表4可知，與清耕處理相比，自然生草處理顯著降低了行間土壤的香農指數、Chao1指數和ACE指數，但對根際土壤香農指數、Chao1指數和ACE指數無顯著影響；長柔毛野豌豆處理提高了行間和根際土壤的Chao1指數和ACE指數，對香農指數無顯著影響。辛普森指數在各處理間均無顯著差異。各處理的覆蓋率均達到了97%以上，說明測序樣本所構建的基因庫可以有效地反映其多樣性，結果可靠。

表4 土壤細菌群落α多樣性統計Table 4 Statistics of soil bacterial community α diversity

2.3.2 土壤細菌群落β多樣性分析 無度量多維標定法(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)統計是以Bray-Curtis距離來分析的非線性模型，將樣本的物種信息以點的形式反映在二維平面上。二維平面上點與點間的距離可體現不同樣本間的差異程度，反映出樣本的組間和組內差異等。由圖2可知，自然生草根際土和長柔毛野豌豆行間土樣本組內差異相對較小，對照根際土樣本組內差異相對較大。與清耕處理相比，生草處理土壤的細菌多樣性產生了一定的差異，從行間土細菌多樣性來看，自然生草行間土樣本與清耕處理土壤的細菌多樣性差異較大；從根際土細菌多樣性來看，自然生草根際土樣本與清耕處理土壤的細菌多樣性差異較大。

注： A1：對照行間土；A2：對照根際土；B1：自然生草行間土；B2：自然生草根際土；C1：長柔毛野豌豆行間土；C2：長柔毛野豌豆根際土。下同。Note: A1: Inter row soil of control. A2: Rhizosphere soil of control. B1: Inter row soil of natural grass. B2: Rhizosphere soil of natural grass. C1: Inter row soil of hairy vetch. C2: Rhizosphere soil of hairy vetch. The same as following.圖2 土壤細菌群落β多樣性分析Fig.2 Analysis of soil bacterial community β diversity

2.4 棗園生草對土壤細菌群落組成及相對豐度的影響

由圖3可知，棗園生草對土壤細菌的群落組成及相對豐度影響較大。在門水平上，相對豐度排名前十的細菌類群為：變形菌門(Proteobacteria，23.7%～45.2%)、放線菌門(Actinobacteriota，12.2%～17.9%)、未明確細菌門(unidentified bacteria，10.6%～17.1%)、酸桿菌門(Acidobacteriota，6.5%～12.9%)、厚壁菌門(Firmicutes，3.3%～8.0%)、綠彎菌門(Chloroflexi，2.3%～5.9%)、粘球菌門(Myxococcota，1.4%～3.8%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirota，1.2%～2.7%)、疣微菌門(Verrucomicrobiota，0.9%～3.0%)、泉古菌門(Crenarchaeota，0.5%～2.3%)。變形菌門、放線菌門和酸桿菌門為優勢種群，其相對豐度之和占42.4%～76.0%。其中變形菌門以自然生草行間土壤樣本最高(45.2%)，放線菌門以長柔毛野豌豆行間土壤樣本最高(17.9%)，酸桿菌門以對照根際土壤樣本最高(12.9%)。

圖3 門分類水平土壤樣本細菌群落相對豐度Fig.3 Relative abundance of soil bacterial community at phylum level

進一步從綱水平進行分析，土壤中主要細菌類群為：γ變形菌綱(Gammaproteobacteria，17.0%～38.8%)、放線菌綱(Actinobacteria，5.7%～12.2%)、α變形菌綱(Alphaproteobacteria，6.4%～8.5%)、芽孢桿菌綱(Bacilli，2.1%～8.5%)、未明確細菌綱(unidentified bacteria，2.8%～6.7%)、病毒桿菌綱(Vicinamibacteria，1.2%～5.9%)、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia，1.5%～4.7%)、酸桿菌綱(Acidobacteriae，2.1%～3.3%)、亞硝基球菌綱(Nitrososphaeria，0.5%～2.3%)、酸微菌綱(Acidimicrobiia，0.4%～2.9%)。優勢菌綱為γ變形菌綱、放線菌綱、α變形菌綱和芽孢桿菌綱，其相對豐度占31.2%～68.0%。其中γ變形菌綱以自然生草行間土壤樣本最高(38.8%)，放線菌綱以自然生草行間和長柔毛野豌豆行間土壤樣本最高(12.2%、12.0%)，α變形菌綱和芽孢桿菌綱均以長柔毛野豌豆行間土壤樣本最高(8.5%、8.4%)。

2.5 土壤細菌群落與土壤主要環境因子之間的關系

土壤細菌微生物群落結構與土壤理化性狀的關系如圖4所示。冗余分析(redundancy analysis)RDA1解釋了土壤微生物群落差異的53.2%，不論行間土還是根際土的冗余分析，清耕與自然生草和長柔毛野豌豆處理在此軸分開，且pH值、容重與RDA1軸和清耕的夾角均為銳角，表明pH值和容重是清耕與自然生草和長柔毛野豌豆處理細菌微生物群落差異的主要影響因子。此外，長柔毛野豌豆和自然生草處理與脲酶、有機質、堿性磷酸酶、全氮、含水量、有效鉀均呈銳角，表明這些因素對棗園生草(長柔毛野豌豆和自然生草)的細菌群落形成上發揮主導作用。

注：CK：清耕；NG：自然生草；HV：長柔毛野豌豆；TN：全氮；AK：有效鉀；OM：有機質；BD：容重；SWC：含水量；URE：脲酶；PHO：堿性磷酸酶。Note: CK: Bare earth. NG: Natural grass. HV: Hairy vetch. TN: Total nitrogen. AK: Available potassium. OM: Organic matter. BD: Bulk density. SWC: Water content. URE: Urease. PHO: Phosphatase. 圖4 不同生草處理土壤主要環境因子與細菌門水平的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of abundance phyla and main soil environmental factors

2.6 棗園生草對果實產量和品質的影響

由表5可知，與清耕相比，長柔毛野豌豆處理可顯著提高果實單果重、可溶性糖含量、Vc含量，降低有機酸含量，但與自然生草相比無顯著差異。果實縱橫徑和硬度在各處理間無顯著差異；類黃酮含量在各處理間差異顯著，以長柔毛野豌豆處理最高。

表5 棗園生草對果實產量和品質的影響Table 5 Effects of planting grass on fruit yield and quality in jujube orchard

3 討論

我國3 000余年精耕細作的農耕文明及其“除草務盡”的傳統理念，成為棗園生草技術不能在中國有效推廣的主要障礙因素，將會導致果園土壤質量持續下降的惡性循環，因此篩選符合我國國情的草種對生草技術的推廣將大有裨益。近幾年，長柔毛野豌豆以莖木質化極低和無需刈割等突出優勢，成為我國乃至世界范圍內果園備受推崇的優勢草種[20-21]。前人的研究多集中在長柔毛野豌豆對果園土壤養分[12]、病蟲害防治[13]、樹體生長和果實品質[22]的影響。本研究以傳統清耕模式為對照，同時加入了自然生草處理，進一步探討了棗園種植長柔毛野豌豆的土壤環境因子與土壤細菌群落之間的互作關系。結果表明，果園生草較清耕處理有效提高了土壤綜合肥力和土壤細菌群落的豐度與多樣性，其中種植長柔毛野豌處理較自然生草處理又進一步提高了土壤營養水平，表明長柔毛野豌豆可作為今后果園生草中的優勢草種。進一步RDA分析表明，生草處理主要通過影響土壤全氮含量、有機質含量、含水量及堿性磷酸酶和脲酶活性，從而有利于增加土壤放線菌門、疣微菌門和變形菌門等有益細菌的豐度，這與姜莉莉等[23]在蘋果園中研究認為生草有助于提高土壤有機質及養分含量，改善土壤微生態環境的結論一致。

土壤有機質含量是評價土壤營養的核心指標[24]。有機質含量提高可促進土壤其他指標同步提高，有利于果園的可持續發展。研究表明我國大部分果園有機質含量不足1%，氮肥利用率不足20%，若有機質含量達到1.5%，氮肥利用率可上升至30%[25]。本研究表明果園生草處理全面提高了土壤綜合肥力，清耕與自然生草處理相比，長柔毛野豌豆處理顯著提高了土壤有機質含量、全氮含量、有效鉀含量和土壤酶活性，與陳學森等[12]在蘋果園中的研究結論一致。但是在蘋果園種植長柔毛野豌豆提高了土壤有效磷含量，而本試驗中各處理間的有效磷含量未見顯著差異，可能是由于磷素在土壤中遷移慢，極易被土壤吸附固定，大多形成不能被植物吸收的無效態磷形式存在[26]，在蘋果園中進行的是多年生草試驗，而本研究一年生草試驗尚不能改變土壤有效磷含量。土壤中的酶在土壤碳氮循環過程中發揮著重要作用，直接或間接參與了土壤中的物質代謝[27]。本研究發現果園生草不同程度地提高了土壤酶活性，其中長柔毛野豌豆顯著提高了土壤脲酶和堿性磷酸酶活性，與吳玉森等[6]在梨園中的研究結論一致。人工生草避免了傳統清耕制條件下施肥后的奢侈吸收和施肥間隔期間的養分匱乏，同時長柔毛野豌豆的根系密度是果樹的幾十倍，速效性肥料撒施后會被草根迅速吸收利用，避免了肥料淋溶損失，提高了養分生物貯存量以及無機態向有機態的轉化，減少養分損失，因此可以充當養分的臨時貯存庫，隨著根系死亡又會將養分釋放到土壤中供果樹根系吸收利用[28]。本試驗是在棗果實完熟期進行土壤取樣，可見種植長柔毛野豌豆使土壤養分供應穩定持久，這種穩定供肥的能力在保肥能力較差的山東省北部鹽堿地棗園顯得尤為重要。

土壤微生物群落結構及多樣性對土壤生態系統的平衡起著重要作用，是評價土壤品質的重要生物學指標。有研究表明生草可顯著提高果園土壤細菌數量[29]。本研究結果表明，長柔毛野豌豆處理較清耕和自然生草處理的物種豐度和多樣性更高。其中長柔毛野豌豆處理的Chao1指數和ACE指數均高于清耕和自然生草處理，表明長柔毛野豌豆能夠提高果園土壤細菌豐度。但清耕處理的ACE指數和Chao1指數略高于自然生草處理，可能因為試驗處理時間較短，而且自然生草群落中夾雜惡性雜草，破換了土壤生態平衡，但是從長期來看，合理管理的自然生草制應優于清耕制度[30]。另外，本研究中3個生草處理的根際土細菌豐度均高于行間土，與Li等[31]認為土壤根際細菌數量和活性顯著高于根外土壤，呈現特異根際效應的結論一致。進一步對各生草處理中的細菌在門和綱分類水平上進行物種注釋，分析發現變形菌門、放線菌門和酸桿菌門為各處理下的土壤優勢菌門，與王曉雯等[32]的研究結果一致。在綱分類水平上，優勢菌綱為γ變形菌綱、放線菌綱、α變形菌綱和芽孢桿菌綱，多是變形菌的不同種類，可能變形菌主導了各分類水平下的優勢菌種。與在雷竹林土壤[33]上的研究結論一致。同時生草處理也影響了土壤細菌群落的β多樣性，生草處理下土壤細菌的物種組成和群落結構均異于清耕處理(對照)，不論行間土還是根際土的細菌群落多樣性與對照相比，生草處理均提高了土壤細菌群落多樣性，自然生草差異較大，長柔毛野豌豆次之。

土壤微生物的群落組成及多樣性極易受土壤自身及外界環境等綜合因素的影響，是土壤質量變化的敏感指標[34]。RDA分析表明，土壤環境因子受長柔毛野豌豆處理影響較大，提高了土壤養分水平，從而有利于增加土壤放線菌門、疣微菌門和變形菌門等有益細菌的豐度。大部分放線菌門是一種腐生菌類，可分解木質素和纖維素，促進土壤中植物有機殘體的降解[35]；大部分疣微菌門有效參與了土壤氮循環的硝化作用，可促進有機氮向無機氮轉化[36]；變形菌門下面的一些亞綱(α、β、γ變形菌亞綱)具有吸收土壤有機碳的能力[37]。可見，棗園種植長柔毛野豌豆是一種可行的技術措施。由于本研究時間較短，后續可開展多年種植長柔毛野豌豆試驗進一步挖掘其益處。

4 結論

與土壤清耕和自然生草處理相比，棗園種植長柔毛野豌豆可提高土壤營養水平，冗余分析表明其主要通過影響土壤全氮含量、有機質含量、含水量、堿性磷酸酶和脲酶活性來改善土壤細菌群落，從而提高果實產量和品質。種植長柔毛野豌豆具有省力、高效的特點，該植物將是棗園生草可推薦的適宜草種。