硝酸還原酶基因啟動子NRE2元件缺失對煙草氮代謝的影響

黨 偉 李 茜 葉歌斐 汪海燕 張玉寧 楊鐵釗 武兆云 楊惠娟,*

(1 河南農業大學國家煙草栽培生理生化研究基地，河南 鄭州 450002；2 浙江中煙工業有限責任公司，浙江 杭州 310000； 3 浙江大學農業與生物技術學院，浙江 杭州 310000； 4洛陽市煙草公司宜陽縣分公司，河南 宜陽 471000)

植物主要以無機氮(NO3--N、NH4+-N)為氮源，其中植物最易吸收的是硝態氮(NO3--N)。NO3-在葉片中通過無機氮的還原同化途徑，合成植物生長發育所需的含氮化合物，如氨基酸、核苷酸、多肽等[1]。研究表明，NO3-不僅是植物氮同化的代謝底物，同時也是一種信號分子[2]。一方面，NO3-是植物感應外界氮營養變化的關鍵信號分子；另一方面，NO3-對植物體內部分生長發育相關的基因具有重要的調節作用，影響植物生長發育、根系形態建成等[3]。這類基因最顯著的表達調控特征是可以迅速受到NO3-的誘導，不依賴于蛋白質的從頭合成，因而被稱為NO3-初級響應基因[4]，其中包括硝酸還原酶基因(nitrate reductase,NIA)。硝酸還原酶(nitrate reductase，NR，EC 1.6.6.1)是氮代謝途徑中的第一個關鍵酶和限速酶，可將NO3-還原成NO2-。劉麗等[5]研究發現硝酸還原酶的合成和降解受到一系列復雜調控機制的調節，其表達受到光、NO3-、蔗糖等外界因素的誘導以及氮代謝產物如谷氨酰胺(Gln)等的反饋抑制。

順式作用元件是啟動子中的一段特異序列，通過與相應的轉錄因子結合，特定地促進或抑制基因的轉錄[6]。對啟動子及其順式作用元件進行研究，既可以在分子層面探究功能基因的誘導表達機制，又可以利用啟動子為作物遺傳改良提供新的思路[7]。研究發現在擬南芥[8]、枳[9]、菠菜[10-11]等多種植物的亞硝酸還原酶基因(Nitrite reductase，NIR)啟動子中都存在一個保守的長度為43 bp的NO3-響應順式作用元件(nitrate-responsive cis-element，NRE)，其核心序列為GACCCTT-N(9-10)-AAG，該序列參與調控NO3-介導的信號轉導途徑。研究發現NO3-信號可以激活根瘤感受基因類似蛋白(NIN-like proteins, NLPs)，NLPs蛋白可以與NIA1基因下游3′端的NRE元件以及NIR1基因啟動子序列中的NRE元件結合，調控NIA1和NIR1基因的表達[12]。Wang等[13]使用小球藻NIA基因啟動子驅動β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因表達，發現GUS基因表達水平在NO3-條件下顯著增加，在NH4+條件下顯著降低。同時，在杜氏鹽藻[14]的研究中也有類似的結果。以上研究表明煙草NIA基因啟動子中可能存在NO3-響應元件NRE。

本研究前期利用生物信息學技術在煙草NIA1和NIA2基因啟動子序列中發現一個GACCCTA-N(10)-AAG的核心序列，暫命名為NRE2元件(表1)，與菠菜和擬南芥相比，該元件在5′端第7個堿基處發生突變，堿基T被替換為堿基A，導致GUS報告基因表達量降低[15]。在此基礎上，本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得煙草NIA1基因和NIA2基因啟動子中NRE2元件缺失的轉基因陽性植株，對煙葉氮代謝相關指標進行測定，研究硝酸還原酶基因啟動子NRE2元件在煙草植株生長發育中的功能，以期為選育低硝酸鹽含量的煙草新品種提供理論依據。

表1 煙草及其他物種NIR基因啟動子NRE元件與煙草NIA基因啟動子NRE2元件序列對比Table 1 Sequence comparison of NRE element of NIR gene promoter and NRE2 element of gene promoter in tobacco and other species

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

普通栽培煙草K326種子由河南農業大學煙草栽培生理實驗室提供。農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404為河南農業大學煙草栽培生理實驗室保存菌株；Murashig-Skoog營養液(Murashig and Skoog Medium，MS)配制參考《植物生理學實驗指導》[16]；DNA marker購自北京Biomed公司；限制性內切酶購自大連TaKaRa公司；植物基因組DNA提取試劑盒購自成都FOREGENE公司；質粒提取試劑盒購自德國Qiagen公司；特異性引物由鄭州擎科生物公司合成；硝酸還原酶活性和亞硝酸還原酶活性檢測試劑盒購自蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

AA3型連續流動化學分析儀，德國BRAN LUEBBE公司；ZHWY-200H型恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；Mastercycler pro型常規梯度PCR儀，德國Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；SPARK 10M型酶標儀，瑞士TECAN公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 gRNA設計及載體構建 在NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索和下載NIA1(GenBank ID：X14058.1)和NIA2(GenBank ID：X14059.1)基因的ATG上游啟動子序列，使用在線分析工具CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在NRE2元件附近選擇合適的靶點，并設計編輯位點(表2)。重組CRISPR/Cas9敲除載體由河南農業大學煙草栽培生理實驗室構建。

表2 用于NIA1和NIA2基因啟動子中NRE2元件敲除的gRNA寡聚核苷酸序列及附近序列Table 2 The gRNA oligonucleotide sequence and nearby sequences for knockout of the NRE2 element in the promoters of NIA1 and NIA2 genes

1.3.2 農桿菌轉化 采用凍融法[17]將載體導入根癌農桿菌LBA4404感受態細胞中，在不含抗生素的農桿菌YEB培養基(yeast mannitol medium)中28℃、220 r·min-1振蕩培養2～3 h，5 000 r·min-1離心1 min收集菌體。重懸后，將菌液均勻涂布在含有抗生素的YEB培養基(含50 mg·mL-1Kana，100 mg·mL-1Strep，50 mg·mL-1Rif)中，28℃恒溫倒置培養48～72 h；挑取單菌落振蕩培養并提取質粒，利用限制性內切酶Pml Ⅰ和Apa Ⅰ進行雙酶切鑒定，獲得可用于遺傳轉化的重組農桿菌。

1.3.3 轉基因陽性植株的獲得 采用農桿菌介導的葉盤法[18]轉化煙草。侵染后，用濾紙吸去葉盤表面的殘留菌液，在MS培養基中暗培養2～3 d。之后用頭孢溶液清洗葉盤，并轉移至選擇培養基(MS+0.15 mg·mL-1NAA+1 mg·mL-16-BA+0.5 mg·mL-1Cef+8 μg·mL-1Hyg)上進行篩選，每7 d更換一次培養基。當愈傷組織分化成芽時，將芽移至生根培養基中(1/2MS+0.15 mg·mL-1NAA+0.5 mg·mL-1Cef+30 μg·mL-1Kana+8 μg·mL-1Hyg)。當煙苗長至五葉一心時進行緩苗處理，后移植到育苗盆中并置于光照培養架上培養。按煙草專用肥∶水=1∶3的比例對煙株施肥，每周施肥一次。獲得的煙草NIA1、NIA2啟動子NRE2元件缺失的單突變體品系命名為△NIA1、△NIA2，雙突變體品系命名為△NIA1+2。

1.3.4 轉基因植株的陽性鑒定 以T0代煙草葉片基因組DNA為模板，依次用潮霉素磷酸轉移酶基因(hygriomycin phosphotransferase,HYG)和Cas9(CRISPR-associated nucle-ase9)基因的特異性引物進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增引物及擴增程序分別如下：

HYG正向引物：5′-G C T C C A T A C A A G C C A A C C A C G-3′

HYG反向引物：5′-C C T G C C T G A A A C C G A A C T G C-3′

擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，30個循環；72℃延伸2 min，4℃保存。

Cas9正向引物：5′-G A G G T C G T G A A G A A G A T G A A G A A-3′

Cas9反向引物：5′-G G T C A G G G T A A A C A G G T G G A T-3′

擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，30個循環；72℃延伸2 min，4℃保存。

1.4 測定項目與方法

在T0代煙株最大功能葉片長至18 cm左右時，摘取中部煙葉并分成兩份，一份于液氮中速凍后保存于-80℃冰箱中，用于NR和NiR活性測定；另一份在殺青后將其磨碎過60目篩，用于葉中NO3-、NO2-和總氮含量測定。每種基因型分別選取5株長勢一致的煙苗進行測定。

NR和NiR活性利用檢測試劑盒在酶標儀上測定；總氮含量在連續流動分析儀[19]上測定。葉中硝酸鹽含量采用濃硫酸-水楊酸比色法測定，亞硝酸鹽含量采用磺胺—α-萘胺法測定[20]。

1.5 數據分析

試驗數據用Excel 2016和SPSS Statistics 23軟件分析，采用LSD法和Duncan法進行差異顯著性檢驗，顯著水平為0.05，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 NRE2元件敲除靶位點的gRNA設計及載體構建

利用NCBI數據庫獲得NIA1和NIA2基因的ATG上游序列和2個NIA基因啟動子的同源序列，通過在線分析工具CRISPR-P在NRE2元件附近的PAM區設計了敲除載體的gRNA寡聚核苷酸序列。在CRISPR/Cas9載體的At U6 啟動子和Pol Ⅲ終止子之間插入gRNA片段后，獲得用于敲除NIA1和NIA2基因啟動子中NRE2元件的單敲除載體與雙敲除載體(NIA1-Cas9-gRNA、NIA2-Cas9-gRNA、NIA1/NIA2-Cas9-gRNA)。重組CRISPR/Cas9載體結構如圖1所示。

圖1 重組CRISPR/Cas9敲除載體結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of recombinant CRISPR/Cas9 knockout vector structure

2.2 轉化農桿菌陽性鑒定與T0代轉基因K326煙株檢測

2.2.1 轉化農桿菌陽性鑒定 利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行鑒定，得到1 430 bp的序列片段，結果如圖2所示。表明重組CRISPR/Cas9載體已經成功轉入農桿菌LBA4404菌株內。

注：M：DL2000 DNA 標記。1～3、4～6、7～9分別為重組載體NIA1-Cas9-gRNA、NIA2-Cas9-gRNA、NIA1/NIA2-Cas9-gRNA的農桿菌菌落雙酶切產物。Note: M: DL2000 DNA Marker. 1～3, 4～6 and 7～9 are the double digestion products of Agrobacterium colonies of recombinant vectors NIA1-Cas9-gRNA, NIA2-Cas9-gRNA, NIA1/NIA2-Cas9-gRNA, respectively.圖2 重組CRISPR/Cas9載體雙酶切電泳圖Fig.2 Double enzyme digestion electrophoresis diagram of recombinant CRISPR/Cas9 vector

2.2.2 T0代轉基因K326煙株檢測 由圖3和圖4可知，從再生煙苗中擴增得到425 bp的HYG基因片段和1 329 bp的Cas9基因片段，表明構建的重組CRISPR/Cas9基因敲除質粒已成功轉入K326 植株中。

注：M: DL 2000 DNA Maker；1～5：△NIA1突變體品系；6～10：△NIA2突變體品系；11～15：△NIA1+2突變體品系。Note: M: DL 2000 DNA Maker. 1～5: △NIA1 mutant strain. 6～10: △NIA2 mutant strain. 11～15: △NIA1+2 mutant strain.圖3 轉基因煙苗的HYG基因陽性鑒定電泳圖Fig.3 Electrophoresis of HYG gene positive identification of transgenic tobacco seedlings

注：M: DL 2000 DNA Maker；1～5：△NIA1突變體品系；6～10：△NIA2突變體品系；11～15：△NIA1+2突變體品系。Note: M: DL 2000 DNA Maker. 1～5: △NIA1 mutant strain. 6～10: △NIA2 mutant strain. 11～15: △NIA1+2 mutant strain.圖4 對HYG基因鑒定為陽性的轉基因煙苗的Cas基因鑒定電泳圖Fig.4 Cas gene identification electrophoresis of transgenic tobacco seedlings identified as positive for HYG gene

2.3 煙葉硝酸還原酶活性和亞硝酸還原酶活性

由表3可知，NIA1和NIA2基因啟動子序列中的NRE2元件被敲除后，與野生型K326相比，突變體△NIA1、△NIA2和△NIA1+2的NR活性分別下降了18.8、25.6和18.1個百分點。△NIA1和△NIA1+2的NiR活性與野生型相比分別升高了2.2和0.2個百分點，△NIA2的NiR活性相比野生型下降了16.6個百分點。

表3 不同基因型煙苗的葉中硝酸還原酶活性和亞硝酸還原酶活性Table 3 Nitrate reductase activity and nitrite reductase activities in leaves of different genotypes of tobacco seedlings /(μmol·h-1·g-1)

2.4 煙葉中硝酸鹽、亞硝酸鹽和總氮含量

表4 不同基因型煙苗的葉中硝酸鹽(NO3-)、亞硝酸鹽(NO2-)和總氮含量Table 4 Nitrate (NO3-), Nitrite (NO2-) and Total nitrogen contents in leaves of different genotypes tobacco seedlings

3 討論

本研究采用CRISPR/Cas9技術敲除煙草NIA基因啟動子中的NRE2元件后，與野生型相比，突變體葉片的NR活性與NO3-含量出現不同程度的降低(表3、表4)，表明NRE2元件與煙葉NR活性有關，該結果與Gao等[21]發現水稻OsNR2基因表達水平降低會引起葉片NR活性與NO3-積累量降低的結果相一致，說明NRE2元件可能參與調控煙草NIA基因的轉錄。

亞硝酸還原酶(NiR)是硝酸鹽同化途徑中的第二個關鍵酶，可將NO2-進一步還原成NH4+，以供給植物進行氮素同化[1]。在本試驗中，轉基因煙草植株葉片的NR活性與野生型相比下降了18.1～25.6個百分點，但NiR活性和NO2-含量與野生型相比仍保持在較高水平，這種現象與擬南芥[22]、豌豆[23]、煙草[24]、大麥[25-26]等植物的研究結果一致，表明NRE2元件的缺失對NO2-還原過程無明顯影響。

植株全氮含量相對穩定，可以很好地反映作物氮素營養狀況[27]。本研究中，單敲除突變體的葉中總氮含量與野生型相比無顯著差異，雙敲除突變體的總氮含量與野生型相比顯著降低，表明單敲除突變體的氮素營養狀況正常，植株能夠正常生長，雙敲除突變體則與之相反。該結果與Warner等[25]和Wilkinson等[28]發現硝酸還原酶單突變體能夠在以NO3-為唯一氮源的培養條件下正常生長，而硝酸還原酶雙突變體卻不能正常生長的結果相一致。推測敲除掉一個NIA基因啟動子的NRE2元件，不影響突變體對氮素的同化利用；當完全敲除掉NRE2元件后，將降低煙株對硝酸鹽的吸收同化能力，導致氮素營養不足。

與野生型相比，單敲除突變體的NR活性低、NO3-積累量少，但總氮含量之間差異不明顯，表明單敲除突變體煙草植株可能會通過其他途徑補償因氮素吸收同化能力下降而導致的氮素營養不足。已有研究表明，使用鎢酸鹽處理煙草植株，導致植株體內NR活性降低，但NR-mRNA持續高表達，NR蛋白水平大幅提高[29]。結合Scheible等[30]和Signore等[31]的研究結果認為，造成本試驗中單敲除突變體的總氮含量與野生型一致的原因可能是：其一，突變體根系NR活性被誘導增加，即NR活性降低的突變體可以通過改變根部NR的調節來補償，而且在黑暗中的硝酸鹽還原同化能力比野生型更強，同化產物(谷氨酰胺、氨基酸等)能被更快地輸出，減弱了產物的反饋抑制。其二，NIA基因表達數量減少的突變體可以通過增加剩余NIA基因的表達，在轉錄和翻譯水平上改變NR的更新和翻譯后調控以獲得氮素同化能力補償。

Wilkinson等[28]研究發現擬南芥中NR活性主要與NIA2基因表達量有關。本研究中△NIA1的NR活性高于△NIA2，NO3-含量低于△NIA2，推測NIA2是煙草NIA基因中的主效基因。另外還發現，△NIA1+2突變體仍具有較高的NR活性，這可能與NLPs蛋白可作用于硝酸還原酶NIA1基因下游3′端的NRE元件有關[12]，認為NIA1基因下游的NRE元件在NRE2缺失時起替補作用，但NRE元件和NRE2元件在調控NIA1基因表達過程中的主次作用尚不可知，有待進一步驗證。

4 結論

本試驗通過CRISPR/Cas9技術構建了硝酸還原酶基因啟動子的NRE2元件缺失突變載體，并轉化煙草獲得了轉基因陽性植株。突變植株的氮代謝相關生理指標測定結果表明，敲除硝酸還原酶基因啟動子的NRE2元件后，煙草植株的葉中NR活性與NO3-含量降低，NiR活性與NO2-含量仍保持在較高水平。僅敲除NIA1和NIA2基因啟動子中的一個NRE2元件，不會對煙株整體的氮素營養狀況產生負面影響；雙敲除后，則明顯降低煙草植株的總氮含量。表明NRE2元件對硝酸鹽的還原同化過程起著重要作用。