增齡因素對人牙髓干細胞生物學行為影響的研究

蔡逸馨，王畇欽，王 娟，李 謹

隨著微創理念和生物活性材料的發展，活髓保存治療受到了廣泛關注，其可最大限度保留剩余健康牙髓組織，提高牙齒遠期保存率，但長期以來被認為適用范圍有限，療效不穩定。這一治療的生物學基礎在于人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)具有良好的增殖與成牙/成骨向分化能力。

目前關于hDPSCs的研究多局限于乳牙、根尖未發育完成的年輕恒牙以及40歲以下患者根尖已發育完成的恒牙[1-4]，對40歲以上患者恒牙研究較少[5-6]。至2020年底，我國60歲及以上人口比重已達到18.7%，老年人牙齒保存不容忽視。有研究發現，隨著年齡的增長，牙髓組織中細胞成分減少，纖維成分增加，同時牙髓干細胞的生物學活性也可能存在增齡性的改變[7-8]，然而關于hDPSCs生物學行為隨年齡變化的基本規律尚不可知。

本研究擬比較不同年齡患者hDPSCs的生物學特性，了解增齡因素對其影響的基本規律，以期為老年人活髓保存治療提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 α-MEM培養基、PBS緩沖液、0.25%胰酶、Ⅰ型膠原酶(Gibco，美國)；胎牛血清(FBS)(Sciencell，美國)；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)(Biosharp，中國)；油紅O染色試劑盒、茜素紅染液、維生素C、氯化十六烷基吡啶(Solarbio，中國)；雙抗(新賽美，中國)；β甘油磷酸鈉、吲哚美辛(Sigma，美國)；地塞米松、胰島素、CCK8檢測試劑盒(APExBIO，美國)；CD34-FITC、CD90-APC、CD73-PEcy、CD146-PE(BD Pharmingen，美國)；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)；qPCR試劑盒(Vazyme，美國)。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺、離心機、二氧化碳恒溫孵箱(Thermo，美國)；倒置相差顯微鏡(Leica，德國)；多色分析流式細胞儀(BD，美國)；微孔板分光光度計(MD，美國)；ABI熒光定量PCR儀(QuantStudio7，美國)。

1.2 研究對象

本研究經南京醫科大學機構倫理委員會批準(PJ2020-094-001)，選擇2020年4月至2020年9月就診于江蘇省口腔醫院口腔頜面外科門診患者，獲取拔除的完整前磨牙或磨牙共計15顆。納入標準：①患者無系統性疾病，口腔衛生狀況良好；②牙齒無累及牙髓的病變；③牙齒根尖已發育完成。

根據Harms等[9]研究及我國年齡劃分標準，本實驗分為3組：A組患牙提供者≤18歲，共5例；B組19～59歲，共6例；C組≥60歲，共4例。

1.3 hDPSCs體外分離、培養與傳代

牙齒拔除后立刻浸泡于含2%雙抗的PBS溶液中，置于超凈臺，PBS充分沖洗血塊等表面雜質，無菌紗布包裹，砸開牙齒，取出牙髓組織，胰酶、膠原酶聯合處理，放入37 ℃、5%CO2孵箱培養，每3 d更換培養液。細胞從組織塊中爬出，達到80%～90%融合后，37 ℃胰酶消化，按1∶3比例傳代。倒置顯微鏡下觀察各組原代和傳代后細胞的形態。

1.4 hDPSCs表面抗原測定

選取第2代hDPSCs，以1×103個/μL密度置于EP管內，每管100 μL，在避光條件下分別加入抗體CD34-FITC、CD90-APC、CD73-PEcy、CD146-PE，4 ℃避光孵育30 min后，流式細胞儀上機檢測。

1.5 成骨向分化誘導實驗

提取第2代hDPSCs，以1×105個/孔密度接種于6孔培養板，A、B、C組均設置對照組及成骨誘導組。對照組常規培養液培養2周，每3 d換一次液。成骨誘導組常規培養液培養1 d后更換為成骨誘導液(α-MEM+10%FBS+2%雙抗+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 mg/L維生素C+10 nmol/L地塞米松)，每3 d換一次液，培養2周。2周后PBS清洗各組細胞，4%多聚甲醛固定30 min，棄固定液。雙蒸水清洗細胞3次，茜素紅染色液染色10 min，雙蒸水洗去殘留染液，每孔加1 mL PBS，顯微鏡下觀察礦化結節形成情況。鏡下觀察后，用10%氯化十六烷基吡啶溶解，置于脫色搖床上30 min，至礦化結節全部無色，將洗脫液轉移至96孔板內，于酶標儀405 nm波長處測定OD值，實驗重復3次取均值。

1.6 成脂向分化誘導實驗

提取第2代hDPSCs，以1×105個/孔細胞密度接種于6孔培養板，每組均設置對照組及成脂誘導組。陰性對照組常規培養液培養3周，每3 d換一次液。成脂誘導組常規培養液培養細胞1 d后更換成脂誘導液(α-MEM+10%FBS+2%雙抗+1 mg/mL胰島素+0.5 mmol/L IBMX+0.2 mmol/L吲哚美辛+2 mmol/L地塞米松)。每3 d換一次液，誘導3周。3周后PBS清洗各組細胞，按油紅O染色試劑盒說明書操作，4%多聚甲醛固定30 min，棄固定液。雙蒸水沖洗3次，加入油紅O染色工作液染色30 min，雙蒸水沖洗2～3次后顯微鏡下觀察脂滴形成情況。

1.7 細胞增殖實驗

提取第4代hDPSCs，以1×103個/孔細胞密度接種于96孔培養板，每3 d換液，培養1周。分別于第1、3、5、7天加入CCK-8，加入2 h后分光光度計450 nm波長下測定OD值，實驗重復3次取平均值。

1.8 成骨誘導下不同年齡組成牙/成骨礦化基因表達的差異

選取第4代hDPSCs進行實驗，實驗分為對照組和成骨誘導組，對照組采用常規培養基培養，成骨誘導組采用成骨誘導液培養，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養7 d，每2～3 d換液。7 d后，RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，熒光定量PCR檢測牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、核心結合因子α1(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ，COL-1)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。引物由北京擎科生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統計學分析

用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。實驗數據用均值±標準差表示。P<0.05即差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hDPSCs體外分離、培養與傳代

各年齡組hDPSCs貼壁后基本呈長梭形，胞體較大，胞核居中。其中C組細胞出現衰老征象：細胞拉長，多形性細胞增多，且細胞核溶解、破裂情況增多(圖1)。患者年齡直接影響細胞爬出時間，隨著年齡增長，細胞爬出所需時間更長，A組、B組與C組之間有明顯統計學差異(P<0.05)(表2)。

P0：原代細胞培養；P1：傳代后的細胞

表2 各組細胞爬出時間比較

2.2 hDPSCs表面抗原測定

本研究將各組分離培養的hDPSCs培養擴增后，用熒光標記的流式抗體CD146-PE、CD90-APC、CD73-PEcy、CD34-FITC檢測hDPSCs表面標志物的表達。結果發現，3組hDPSCs均高表達CD73、CD90(表達率>90%)，低表達CD146(表達率<20%)，不表達CD34(表達率<1%)(圖2)。

圖2 各組牙髓干細胞表面抗原測定

2.3 成骨向分化誘導實驗

茜素紅染色大體觀察發現各成骨誘導組染色均呈陽性，與對照組有明顯差異(圖3a)。倒置顯微鏡下觀察發現，與對照組相比，各誘導組細胞均可見散在的、密度與大小不一的紅色礦化結節。且年齡越大，礦化結節分布越松散、數量減少、單個結節面積減少(圖3b)。茜素紅半定量分析鈣鹽沉積量結果顯示，3組hDPSCs經成骨誘導處理后， 細胞鈣鹽沉積量均顯著高于相應對照組(P<0.05)，而且隨著年齡的增長，鈣鹽沉積量明顯下降(P<0.05)(圖3c)。

a：茜素紅染色結果肉眼觀；b：茜素紅染色鏡下觀( ×4)；c：茜素紅半定量測定;*：P<0.05

2.4 成脂向分化誘導實驗

各組細胞經3周成脂誘導液培養后油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察均可發現明顯的脂滴，與對照組有明顯差異(圖4)。此外，鏡下觀察顯示C組較其余兩組脂滴形成明顯增多。

圖4 油紅O染色結果

2.5 細胞增殖實驗

細胞生長的第1～5天，各組均具有較強的增殖能力，至第7天時生長基本進入平臺期，甚至較第5天有所下降(圖5)。第1天至第5天，各組間具有明顯的差異(P<0.05)。第7天時，A、B兩組增殖能力無明顯差異，但C組增殖能力較其余兩組明顯下降(P<0.05)。

*：P<0.05

2.6 各組細胞成骨誘導下成牙/成骨基因表達情況

在成骨誘導液培養下，A、B組成骨誘導細胞DSPP、OCN、RUNX2、OPN mRNA的表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，COL-1 mRNA與對照組無明顯差異(P>0.05)；C組DSPP、OCN的表達水平較對照組明顯上升(P<0.05)，RUNX2的表達與對照組相比并無明顯差異(P>0.05)，OPN、COL-1的表達較對照組下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

*:與對照組相比，P<0.05

3 討 論

老年人群口腔保健意識較差，中重度牙周炎、根面齲發病率較高[10-11]，牙齒拔除時牙髓大多已被炎癥累及。另外，患者牙齒長期受到磨耗及生理或病理性刺激，大量反應性牙本質形成，髓腔縮窄甚至閉鎖。這些均導致牙髓組織提取難度較大，使老年患者活髓保存治療的相關研究受到一定限制。本研究中，60歲及以上患者4例，最高供體年齡76歲，均成功分離培養hDPSCs。

之前研究中將所有年齡的牙髓干細胞同等化，忽略了其增齡性的改變，具有局限性。因此，本實驗將患牙按患者年齡階段進行分組，以體現增齡性因素對hDPSCs生物學行為影響。

目前已有研究發現，乳、恒牙牙髓干細胞的免疫表型、周期分布等并無明顯差異[12]，提示乳、恒牙均可嘗試活髓保存治療。本研究中流式測定結果顯示各組細胞高表達間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)表面標志物CD73、CD90(>90%)，低表達血管內皮細胞標志物CD146(<20%)，不表達造血干細胞標志物CD34(<1%)，證實了各年齡組牙髓細胞確實為MSC，同時提示老年人hDPSCs也可以擁有良好的增殖和分化能力。

本研究中，各組hDPSCs均具有一定的增殖能力，并存在增齡性降低。老年人的牙髓組織中，細胞成分減少，纖維成分增加。并且隨著年齡增加，成牙本質細胞發生退行性變，出現空泡、萎縮，細胞質內細胞器減少，嚴重時部分或全部細胞消失[13-14]，最終導致細胞增殖減弱。Wu等[15]應用流式細胞術比較了不同年齡患者hDPSCs的分化能力，發現55～67歲組分化能力部分減弱。本研究發現年齡越大，成骨能力越低，60歲及以上患者hDPSCs雖然有一定的成牙/成骨向分化能力，但是明顯較低年齡患者hDPSCs差，且形態欠佳。隨著年齡增長，牙髓干細胞自我調節能力改變，最終導致喪失一部分生物學效能，機體抗氧化能力不斷下降，體內氧自由基(reactive oxygen species，ROS)不斷蓄積，使得細胞內氧化及抗氧化機制失調，從而導致細胞的生理生化和代謝功能障礙，誘發細胞衰老[16]。但是，牙髓干細胞衰老對其成牙/成骨向分化的具體影響機制尚缺乏研究。Bakopoulou等[17]證實Wnt/β-catenin信號通路的激活可提高牙髓干細胞RUNX2、COL-1等礦化基因的表達水平，促進其成骨向分化，而年齡增長引起的細胞應激增加導致叉頭狀轉錄因子O的激活，抑制Wnt/β-catenin信號通路的傳導，最終抑制骨形成[18]。由此可以推測，Wnt/β-catenin信號通路的抑制可能是牙髓干細胞增齡性功能下降的重要原因之一。因此，臨床上應用活髓保存治療老年患者時需要更加謹慎。MTA、iRoot BP、Biodentine等改良生物活性蓋髓材料的出現或將有助于增強老年人hDPSCs的增殖和分化能力，提高該人群活髓保存治療的成功率，已有研究證實了它們對hDPSCs的增殖和成牙/成骨向分化能力具有明顯的促進作用[19-21]。

雖然本研究中，60歲及以上患者hDPSCs成脂誘導后形成的脂滴明顯較其余各組多，但這并不能說明其功能良好，可能是過多ROS引起脂肪代謝功能障礙，導致脂質過氧化，最終促成細胞損傷、衰老甚至死亡。p21、p53、pRb、p16是參與細胞衰老最重要的分子，已有大量實驗證明，這些分子可直接或間接調控hDPSCs的衰老進程[22-26]。

本實驗從細胞層面上為老年人牙髓的保存提供了參考，對于hDPSCs的衰老影響成牙/成骨向分化的具體機制以及機制的合理調控方法，仍有待于今后的進一步研究。